基于RNA-seq研究柞蚕蛹免疫调控基因

作     者：付盈盈 

作者单位：黑龙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：马玉堃

授予年度：2016年

学科分类：090504[农学-特种经济动物饲养（含：蚕、蜂等）] 0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：柞蚕 大肠杆菌 苏云金芽孢杆菌 免疫 RNA-Seq 

摘      要：鳞翅目昆虫的免疫系统与脊椎动物不同,只具有先天免疫系统,既没有T淋巴细胞和B淋巴细胞存在,也没有补充系统。先天免疫系统又分为体液免疫和细胞免疫,在昆虫免疫防御中起着至关重要的作用。细胞免疫是通过血浆细胞来吞噬外源物。而体液免疫有分Toll途径和IMD途径,不同外源物的刺激可以激活Toll途径和IMD途径,促进与免疫有关的各种大分子物质产生,这些大分子物质包括抗菌肽、溶菌酶和抗菌蛋白等。不同外源物的侵染,激活不同的免疫防御途径。为明确革兰氏阳性菌与阴性菌对柞蚕蛹的免疫反应机制,本研究利用革兰氏阳性菌苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringeinsis(Bt)和革兰氏阴性菌大肠杆菌Escherichia coli(E.coli)为外源物,将菌液调整至106?108 cfu/mL,灭活后处理柞蚕蛹,分别诱导24,48,72和96 h后测定血淋巴蛋白含量、酚氧化酶(PO)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、抗菌活性和溶菌酶活性等生理指标。Bt和E.coli处理均能引起柞蚕蛹产生明显防御反应,其生理指标变化规律与微生物种类及诱导间和菌液浓度有关。基于RNA-Seq技术,分别对处理组(Bt和E.coli)和对照组(CK)进行测序,分别产出56.29×106、56.86×106、81.36×106条高质量序列,测序深度达4G,Q20高达96%以上,产量和质量满足后续分析要求。Bt组共有2271个差异基因,其中有1562个上调,709个下调。E.coli共有3224个差异基因,其中有1916个上调,1308个下调,分别注释到GO功能的生物过程、细胞组分和分子功能3大类共53个GO分类中;分布在314条KEGG通路中,代谢途径(Metabolic pathways)最多,而注释到COG中的25类,其中R(General function prediction only)的最多。利用荧光定量PCR技术,对转录组中筛选的基因进行验证,在Bt和E.coli处理的柞蚕蛹中,在不同时间不同浓度表达量的变化,为进一步揭示柞蚕免疫反应提供基础。我们成功的克隆FADD、c-lectin、hemolin、β-attacin、gloverin和IMD基因,进行序列分析,构建系统进化树,为进一步揭示柞蚕感染革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的免疫机制奠定基础。