一株来源于条纹斑竹鲨肠道的芽孢杆菌GFP-2的分离、鉴定及其抗菌活性研究

作     者：许国强 

作者单位：浙江理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吕正兵

授予年度：2018年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：条纹斑竹鲨 芽孢杆菌GFP-2 抑菌活性 全基因组测序 抗微生物肽 β-1,3-1,4-葡聚糖酶 

摘      要：目前,抗生素的滥用和抗生素耐药性病原体的迅速增加已经对人类构成了严重的威胁,微生物天然产物被认为是抗生素的重要替代品。现已投入使用的大部分天然产物衍生物来源于陆地,但是来源于海洋的活性物质也可以为发现新药提供宝贵的资源。对比分析表明,与陆地天然产物相比,从海洋来源获得的天然产物在化学成分上更加多样化。本课题从条纹斑竹鲨肠道中分离获得一株活性菌株,将其命名为GFP-2,对其抗菌活性进行初步探究,同时开展相应GFP-2菌制剂在虹鳟养殖中的功效研究。抗菌实验结果表明GFP-2菌株对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有良好的抑制作用。对GFP-2菌株进行16S rRNA基因检测,并在NCBI核酸数据库中进行对比,表明GFP-2菌株是属于B.velezensis的一种新型菌株。芽孢杆菌GFP-2现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏号为CGMCC NO.13337。国家知识产权局也受理了该菌株的分离方法及其应用,专利申请号为201710044718.4。通过硫酸铵盐沉淀的方法提取芽孢杆菌GFP-2的胞外代谢产物中的粗蛋白,当硫酸铵饱和度达到20%时,发现有大量沉淀产生。利用浓度为1 mmol/L的NaPO(pH 7.0)缓冲液将沉淀重悬后可以得到澄清的黄色液体,即为胞外代谢产物中的粗蛋白。抗菌实验结果显示该粗提物对枯草芽孢杆菌WB800N和大肠杆菌BL21均有明显的抑菌圈,说明芽孢杆菌GFP-2是通过分泌蛋白物质抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长。通过截留分子量为10 kDa的超滤管对粗蛋白进行初步分离,获得大分子和小分子粗蛋白样品,分别进行抗菌实验。抗菌实验结果发现无论是大分子还是小分子粗蛋白样品,对枯草芽孢杆菌WB800N和大肠杆菌BL21均有明显的抑菌圈,推测芽孢杆菌GFP-2可能是通过分泌不同大小的蛋白对指示菌株起到抑菌的作用。基于SMRT测序技术,对芽孢杆菌GFP-2进行基因组测序,发现其基因组含有3711个蛋白编码序列,在一个环状染色体上(3975220 bp)平均GC含量为46.4%。该基因组可以编码LCI、YFGAP和hGAPDH样抗微生物肽(AMPs)及β-1,3-1,4-葡聚糖酶(bgl)。在基因组中可以预测Difficidin、Bacillibactin、Bacilysin、Surfactin、Butirosin、Macrolactin、Bacillaene、Fengycin和Lanthipeptides等次生代谢物基因簇,还可以预测Lanthipeptides和LCI等细菌素基因簇。因此,推测芽孢杆菌GFP-2可能是通过bgl、抗微生物肽、次级代谢物和细菌素的相互协作起到抗菌作用。通过bgl鉴定实验发现,芽孢杆菌GFP-2的代谢产物粗蛋白可以在鉴定培养基中形成明显的水解圈,说明在该代谢产物粗蛋白中存在bgl类物质。为了验证bgl的抗菌活性,首先利用原核表达系统将bgl克隆、表达和纯化,获得纯度较高的bgl重组酶,然后通过抗菌实验鉴定其抑菌活性。实验结果显示bgl重组酶对枯草芽孢杆菌WB800N和大肠杆菌BL21均有明显的抑菌圈,表明bgl确实对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑制作用。由此说明芽孢杆菌GFP-2其中一个抗菌机制是通过分泌bgl蛋白起到抑菌的作用。在活性菌株GFP-2菌制剂的虹鳟动物实验中,投喂GFP-2菌制剂的实验组虹鳟鱼总重量在投喂30个试验周期后比对照组重811 g,实验组的饲料转化率也低于对照组0.9。对比对照组,在试验期间内投喂GFP-2菌制剂可以提高49.2%的虹鳟存活率,这也为作用于其他鱼类或者其他动物提供部分实验数据,为之后新药的研发奠定良好的基础。因此,条纹斑竹鲨肠道微生物来源的芽孢杆菌GFP-2有可能被开发为一种有效可行的抗菌药物,并以此来替代目前正在被泛滥使用的抗生素。