鸡痘免疫增强型核酸疫苗构建及免疫评价

作     者：洪琴 

作者单位：东北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李广兴

授予年度：2011年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：鸡痘病毒 FPV ENV基因 ChIFN-γ 免疫佐剂 

摘      要：本实验将疑似“混合型鸡痘的病料进行病理学检查,发现皮肤、气管和喉头病料的细胞胞浆内嗜酸性染色的A型包涵体。病原分离鉴定表明,病毒能在10日龄鸡胚绒毛尿囊膜上形成典型的痘斑,并在CEF上形成鸡痘病毒典型病变。据GenBank发表的FPV美国标准强毒株基因序列,利用Oligo 6.0和Primer 5.0软件设计1对扩增4b core蛋白基因引物,通过PCR扩增测序及动物回归试验证明所分离的病毒是鸡痘病毒(FPV),命名为HH2008。 本实验根据Afonso等人已发表的FPV核苷酸全序列(AF198100),针对FPV140上下游设计了1对引物,PCR扩增出FPV140完整的开放阅读框,进行亚克隆构建原核表达质粒pET30a-ENV,表达蛋白大小约为42 ku。制备兔抗ENV多克隆抗体,抗体效价可达到2,Westernblot检测发现多抗血清特异性好,可通过ELISA鉴定鸡痘病毒。 本试验将FPV ORF140基因亚克隆至pVAX1真核表达载体中,构建了重组真核表达质粒pVAX-ENV。利用一段编码(GS)多肽的碱基Linker将ChIFN-γ分别与FPV ENV基因进行连接,成功构建pVAX-ENV-IFN融合基因真核表达质粒。通过脂质体转染法将pVAX-ENV和pVAX-ENV-IFN转入BHK21细胞中并检测到目的蛋白表达。重组真核表达质粒免疫雏鸡进行体内表达检测,ENV基因和ENV-IFN融合基因能够在体内进行表达,同时表达后的融合蛋白可以被ChIFN-γ多克隆抗体和FPV ENV多克隆抗体检测出来,进一步证明了融合基因表达的蛋白保留了融合前两段基因各自的生物学活性,为后续动物试验提供了理论基础。 动物免疫试验分为5个组,即E组(FPV ENV基因真核表达质粒免疫组)、E-I组(pVAX-ENV-IFN真核表达质粒免疫组)、V组(鸡痘商品化疫苗免疫组)、P组(pVAX1空质粒免疫组)和PBS对照组(B组)。利用淋巴细胞转化试验、酶联免疫吸附试验和流式细胞术对不同处理组雏鸡的各项免疫指标进行了检测,最后应用病毒攻击试验比较不同质粒免疫组间保护率的差异。结果表明,免疫组各日龄雏鸡免疫指标均比pVAX1空载体组和PBS组高,以ENV-IFN融合基因的结果尤为显著。其中T、B淋巴细胞增殖功能、CD4、CD8、T细胞数量和外周血液中抗FPV ENV特异性抗体与pVAX1空载体组和PBS组相比较都有明显的提高,且以融合基因组和疫苗组最为显著。综上所述,ChIFN-γ基因在配合FPV抗原基因免疫过程中,机体免疫应答能力增强,提高了机体抵抗病毒的攻击能力。本试验构建ChIFN-γ与病毒抗原基因融合基因质粒鸡免疫保护试验为进一步研究ChIFN-γ生物学活性提供了试验依据,同时为探讨研制新型免疫增强型抗病毒疫苗提供了理论基础。