人精液和卵泡液中抑制素B（INH-B）的分离纯化与鉴定研究
作者单位：北京协和医学院
学位级别：硕士
导师姓名：于和鸣
授予年度：2015年
学科分类：1010[医学-医学技术（可授医学、理学学位）] 10[医学]
摘 要：研究背景：血清抑制素B(INH-B)的检测在男性不育症的诊治中已逐渐得到广泛的应用。一般认为INH-B更能直接反映睾丸的生精功能,并具有无创性的优点,可作为评价男性生育力的重要指标,诸如预测非阻塞性无精症患者行睾丸穿刺能否获得精子的参考依据。目前国际国内应用的血清INH-B检测试剂盒几乎全是英国DSL公司的产品,且价格昂贵。DSL公司以Groome NP实验室的雄厚研究基础为支撑,将其研究结果成功转化。查阅文献凡INH-B研究所用的抗体最初都是该实验室惠赠。在90 s年代开发出第一代INH-B ELISA检测试剂盒,在2000年又改进推出第二代产品。本研究课题的立项源于市场的需求,因国内尚无自主知识产权的INH-B检测试剂盒,在某试剂公司的要求下进行合作开发国产化产品。研究目的：制备高特异性、高亲和力的单克隆抗体是研发的核心问题。因此,本研究将集中开展INH-B单抗制备的关键步骤与必要条件的探索。研究表明,男性体内IN的重要生理活性形式为INH-B,其组装过程大部分在生精细胞内完成,然后释放到循环系统和精液中。女性卵泡液中INH-B的含量为几十ng/ml～几百ng/ml,比血液及精液中的含量高约103倍本实验拟尝试从人精液和/或人卵泡液中分离纯化INH-B,为单抗的筛选提供天然抗原分子。由于对人精液和卵泡液中INH-B的研究相对薄弱,更多的研究资料来源于动物,因此本研究还将对其存在形式和理化性质获得更直接的资料。主要目的有三个：1.探索人精液和卵泡液中INH-B的有效分离纯化方法。2.鉴定人精液和卵泡液中INH-B的可能分子存在形式。3.扩大人卵泡液中蛋白质组成的信息资料。研究路线与方法：1.目的蛋白的富集：采用人精液和卵泡液为研究材料,分别利用乙腈、丙酮、乙醇三种有机溶剂沉淀法去除样品中的高丰度蛋白,富集低丰度蛋白INH-B,以及利用饱和硫酸铵分级沉淀方法,比较四种方法对于低丰度目的蛋白INH-B的富集效果。以INH-B ELISA检测盒的结果为依据,跟踪监测并比较四种方法对于低丰度目的蛋白INH-B的富集效果。2.选用DEAE-Sephadex A-50阴离子交换柱和羟基磷灰石柱层析、肝素亲和柱方法,分离初步富集的样品以进一步纯化。同样方法监测并比较三种方法对于样品的分离纯化效果。3.利用蛋白质等电点分离法(Rotofor System)对富集样品和柱分离样品分别做等电分离比较,以确定柱分离步骤的有效性,同时鉴定INH-B的等电点。4.利用免疫共沉淀(CO-IP)和Western-blot方法寻找阳性条带,利用质谱分析方法鉴定样品中INH-B的α、βB两个亚基的分子存在形式及成熟卵泡液中部分蛋白质的组成。研究结果：1.由于精液特殊的粘稠性(含大量的精胶蛋白),在对其进行有机溶剂蛋白沉淀和饱和硫酸铵分级沉淀的过程中,去除精胶蛋白的同时会损失大部分的INH-B。因此,经多次实验验证后,我们放弃了对于精液中INH-B的分离纯化和鉴定研究。2.卵泡液样品经丙酮、乙醇、乙腈处理后分别可清除60.9%、46.3%、88.7%的高丰度蛋白,同时乙腈法能回收61.8%的INH-B。3.通过比较肝素亲和柱方法、DEAE-Sephadex A-50阴离子交换柱和羟基磷灰石柱层析三种方法,其中第二种方法最稳定,并且能回收样品中83.2%的INH-B。4.乙腈沉淀处理的卵泡样品中仍有较多的杂蛋白,因此,经DEAE-Sephadex A-50阴离子交换柱处理后的样品比直接用乙腈沉淀样品做Rotofor System分离的效果要好。其中,INH-B的回收率为75.3%,卵泡液中INH-B的pI在4.55左右。5.通过质谱方法,鉴定出六种成熟卵泡液中存在的蛋白质,分别是载脂蛋白D(Apolipoprotein D)、载脂蛋白A(Apolipoprotein A)、载脂蛋白M(ApolipoproteinM)、视黄醇结合蛋白4 (Retinol-binding protein 4)、甲状腺素运载蛋白(Transthyretin OS)、SERPINA1蛋白Alpha型抗胰蛋白酶(SERPINA1 Isoform 2 of Alpha-1-antitrypsin)。结论：1.卵泡液是INH-B研究的最合适材料。同时,利用乙腈法处理卵泡原液去除高丰度蛋白是最有效的方法并能保留较多的INH-B。2.使用人卵泡液为实验材料,利用INH-B本身的生化性质,通过乙腈富集、阴离子交换柱分离、等电点分离的“三步分离法,初步纯化获得人体卵泡液中天然INH-B蛋白分子粗制品,纯化回收率达38.7%,并较准确鉴定出其在人体中的等电点为4.55。3.利用现有的商品化抗体并没有鉴定出在精液和卵泡液中INH-B的分子存在形式。但经多个步骤纯化已经获得相对含量较高的INH-B粗制品
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