山东地区结直肠癌患者错配修复蛋白缺失和RAS基因突变的调查研究

作     者：张翔雁 

作者单位：青岛大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邢晓明

授予年度：2018年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：结直肠癌 错配修复蛋白缺失 RAS基因突变 BRAF基因突变 免疫组化 

摘      要：背景与目的结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是我国常见的恶性肿瘤,它的发生是多基因、多因素参与的复杂过程,其中错配修复蛋白缺失(mismatch repair,MMR)引起的微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI)是一个重要机制。有研究显示,MSI结直肠癌有着独特的临床病理特征,但由于地域和民族的差异,这些结论存在一定的争议。RAS(包括KRAS、NRAS)基因是目前结直肠癌基因靶向治疗研究的热点。尽管关于KRAS的报道较多,但是大部分研究的标本量都不是很大。而且,dMMR与RAS突变的相关性也需要进一步的探讨。BRAF基因是RAF家族成员。BRAF突变准确和快速的检测,对结直肠癌和甲状腺乳头状癌患者的诊断及治疗有着重要的意义。有国外研究显示BRAF VE1免疫组化抗体检测BRAF V600E基因突变也能取得较满意的结果,但是对于结直肠癌和甲状腺乳头状癌组织,具体染色条件及阳性判读标准还存在一定的争议。因此,我们收集原发性结直肠癌病人的临床病理数据,分析dMMR、RAS基因突变与临床病理特征的相关性,探讨dMMR和RAS基因突变对结直肠癌病人预后的影响。同时,本组实验用全自动免疫组化染色仪探索结直肠癌和甲状腺乳头状癌石蜡包埋组织合适的BRAF VE1抗体免疫组化染色条件并评估免疫组化方法的敏感性和特异性。材料与方法1.结直肠癌患者错配修复蛋白缺失及RAS基因突变情况的检测1.1收集原发性结直肠癌样本813例,并对病人进行随访。1.2通过免疫组化方法检测四个错配修复蛋白MLH1、PMS2、MSH2和MSH6的表达情况。1.3通过ARMS-PCR方法检测RAS基因(包括KRAS、NRAS)的突变情况。2.结直肠癌及甲状腺乳头状癌中BRAF V600E突变情况的检测2.1选用8例经测序证实BRAF状态的标本(2例为BRAF V600E突变型结直肠癌,2例为BRAF野生型结直肠癌,2例为BRAF V600E突变型甲状腺乳头状癌,2例为BRAF野生型甲状腺乳头状癌),进行BRAF V600E蛋白检测探索最佳的染色条件。2.2选取最佳的条件,对255例(123例结直肠癌和132例甲状腺乳头状癌)组织用VENTANA全自动染色机进行免疫组化染色。2.3用ARMS-PCR法检测255例肿瘤组织中BRAF V600E突变状态,免疫组化和ARMS-PCR不一致的病例使用Sanger测序方法进行验证。结果1.813例样本中,15.18%(121/797)的样本存在dMMR。dMMR好发于低年龄患者(50岁)及右半结肠,且在粘液腺癌、分化差及早期肿瘤分期的患者中更常见。***突变率为42.56%(346/813),NRAS突变率为3.69%(30/813)。KRAS突变与粘液腺癌、早期肿瘤分期、非吸烟患者及结直肠癌家族史有关。NRAS突变与各临床病理参数无相关性。***和KRAS基因突变与病人的预后无关。4.结直肠癌和甲状腺乳头状癌组织BRAF V600E免疫组化最适合的抗原修复时间分别为32min和64min。5.与ARMS/Sanger测序法比较,免疫组化法检测结直肠癌和甲状腺乳头状癌BRAF V600E基因突变的一致性分别为99.2%(122/123)和96.2%(127/132)。结论1.存在dMMR的结直肠癌有独特的临床病理特征,包括好发于低年龄患者及右半结肠,倾向于低分化及黏液腺癌等。***基因突变好发于粘液腺癌、非吸烟患者及结直肠癌家族史的患者,NRAS突变与各临床病理参数无相关性。***、KRAS和NRAS基因突变与结直肠癌患者的预后无关。4.应用BRAF VE1抗体免疫组化法检测BRAF V600E突变与基因检测方法具有很高的一致性,值得在临床推广。