双酶共固定及选择性氧化芝麻菜苷

作     者：周筱 

作者单位：北京化工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：梁浩;赵抒娜

授予年度：2015年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 10[医学] 

主      题：芝麻菜苷 莱菔硫烷 葡萄糖氧化酶 辣根过氧化物酶 选择性氧化 固定化 

摘      要：十字花科植物拥有优良的防癌抗癌效果,这与其含量丰富的硫代葡萄糖苷有着密不可分的关系。莱菔硫烷是十字花科植物的一种次级代谢产物,它可由一种名叫glucoraphanin的硫代葡萄糖苷经黑芥子酶水解产生。莱菔硫烷是阶段Ⅱ酶的主要诱导物,并且具有很高的抗癌活性。芝麻菜是十字花科植物的一种,起源于地中海地区现在广泛分布于世界各地。芝麻菜中芝麻菜苷的含量占其干重的3%,通过将芝麻菜苷的硫醚基团氧化成亚砜基团可以将芝麻菜苷转化为glucoraphanin。多种酶和细胞均已被用于硫醚的选择性氧化,其中辣根过氧化物酶一种血红素过氧化物酶表现出了良好的硫醚选择性氧化功能。而通过葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖在体系中原位生成双氧水可以使双氧水在体系中均一缓慢的产生,而产生的双氧水又很快的被辣根过氧化物酶所利用可以提高辣根过氧化物酶的活性。近年来,多酶系统已通过许多方法被开发。多酶共固定化技术的主要优点是不同酶的活性位点在纳米材料彼此接近,从而将连续反应中中间体的扩散限制在一个很小的范围内以提高反应的整体效率和特异性。在本文中,我们首先利用双酶体系催化氧化芝麻菜苷制备具有手性亚砜基团的glucoraphanin。之后将双酶用四乙氧基硅烷包埋。并应用于芝麻菜苷的氧化。(1)对芝麻菜苷进行了纯化,纯度在95%以上,优化了双酶共催化氧化芝麻菜苷的条件：温度28℃,pH=7.0,葡萄糖浓度36 mM,葡萄糖氧化酶与辣根过氧化物酶浓度都为0.2 mg·mL-1,反应240min。并最终得到了光学纯的亚砜基团。(2)利用TEOS对双酶进行了包埋,最佳的包埋反应条件：链接好的酶5mg,0.4mL去离子水,7.5mL环己烷,并加入[riton-X-100 1.75mL,正己醇1.8mL, TEOS 250μL,25%氨水60gL,搅拌24h(其包埋率可以达到91.6%)。其催化反应速率为游离酶的2.12倍。(3)对双酶包埋物的温度和pH稳定性进行了研究,证明其温度和pH稳定性明显好于游离酶。接着考察了双酶包埋物的周转数,在经过9次反应后,转化量为第一次的73%。