hemH-lba基因表达调控对莱茵衣藻cc124生长和产氢的影响
作者单位：上海师范大学
学位级别：硕士
导师姓名：王全喜;吴双秀
授予年度：2013年
主 题：莱茵衣藻 豆血红蛋白 叶绿体转化 表达调控 产氢 生长
摘 要：莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)结构简单，生长速度快，培养容易且成本较低，遗传学背景清晰，分子操作容易，尤其是其氢化酶(hydrogenase，H2ase)活性高，在无氧条件下，能利用太阳能把细胞内有机物分解产生的H+和e-或者光合作用过程中产生的H+和e-合成H2并释放到细胞外，被认为是目前具有极大开发潜力的生物制氢的模式物种。 但是，莱茵衣藻的氢化酶对氧气特别敏感，而氧气又是光合作用的产物，所以在产氢的过程中，氢化酶很容易受氧气抑制而失活，这是衣藻产氢技术应用的最大障碍。因此，为了提高产氢效率，就要降低衣藻细胞内的氧气含量，保证氢化酶的活性。目前最常用的办法是去除培养基中的硫元素或加入某些抑制剂来抑制光系统II的活性，以减少光合作用产生的氧气量，但是同时也会降低光解水产生的电子量，使光合产氢的电子来源减少，导致产氢量降低。因此，如何既降低细胞内的氧气含量、又不影响电子的供应，是提高莱茵衣藻产氢的关键问题。 豆血红蛋白(leghemoglobin，Lb)与氧气具有很高的亲和力和快速的氧周转率，能帮助降低根瘤细胞内的氧气浓度和保证同样对氧敏感的固氮酶的活性。本实验室前期工作已经尝试将hemH-lba(亚铁螯合酶基因hemH-球蛋白基因lba)转入莱茵衣藻的叶绿体中表达，使产氢量比对照藻849提高了约3.0倍，并通过密码子优化的方法提高了hemH-lba基因表达量，进一步使产氢量提高了约50%。本研究进一步通过调控hemH和lba基因终止子的有无和转入不同的莱茵衣藻藻株来研究hemH-lba基因表达对衣藻产氢和生长的影响。通过将密码子优化后的hemH-lba基因(即hemHc-lbac基因)和去掉hemHc基因和lbac基因终止子的hemHc-lbac基因(命名为hemHc-lbac-M)分别利用基因枪法转入具细胞壁的莱茵衣藻藻种cc124(以下简称对照藻124)的叶绿体中，比较不同hemHc-lbac基因结构的表达对对照藻cc124生长和产氢的影响，主要研究内容和结果如下： (1)将去掉hemHc和lbac基因终止子的hemHc-lba基因合成后，成功构建了表达载体cg401-1-hemHc-lbac-M(将含未去掉终止子的hemHc-lbac基因的表达载体命名为cg401-1-hemHc-lbac)。 (2)利用基因枪法将载体cg401-1-hemHc-lbac和cg401-1-hemHc-lbac-M分别转入到对照藻124的叶绿体中，经抗生素——壮观霉素(spectinomycin)筛选以及固体-液体反复继代培养，成功获得转基因藻株cc124-hemHc-lbac和cc124-hemHc-lbac-M。 (3)通过PCR和RT-PCR方法对转基因藻cc124-hemHc-lbac和cc124-hemHc-lbac-M进行DNA和RNA水平的检测，PCR结果证实hemHc-lbac及hemHc-lbac-M基因片段已异质化整合到衣藻转化子的叶绿体基因组中，RT-PCR结果表明hemHc-lbac及hemHc-lbac-M基因在转基因衣藻的叶绿体中得到成功转录。 (4)对对照藻124和转基因藻cc124-hemHc-lbac、cc124-hemHc-lbac-M的生长情况进行检测表明：OD750值均在培养的第四天达到最大，转基因衣藻cc124-hemHc-lbac-M和cc124-hemHc-lbac的OD750值最高分别达到约3.65和2.80，对照藻124的OD750值最大约为3.85;相应的细胞数也在第四天达到最大，分别为大约2.16×107个/mL，1.35×107个/mL和2.07×107个/mL;相应的叶绿素含量均在第五天达到饱和，分别为39mg/L，31mg/L和41mg/L。此结果表明，转基因衣藻cc124-hemHc-lbac-M的生长未受明显抑制，而转基因藻cc124-hemHc-lbac的生长受到明显抑制。 (5)通过优化产氢培养条件下光照强度和细胞浓度的正交实验、以及对转基因藻和对照藻124产氢量、耗氧量进行检测表明，在光照强度30μmolquanta.m-2.s-1、细胞浓度1.5mg?bottle-1的条件下对照藻124和转基因藻cc124-hemHc-lbac和cc124-hemHc-lbac-M的产氢量均达到最高，分别为645.57μl/mgchl，947.09μl/mgchl和955.99μl/mgchl，两个转基因衣藻的产氢量比对照藻分别高31.8%和32.5%。而在光照强度60μmol quanta.m-2.s-1、细胞浓度为1.0mg?bottle-1的条件下，三种衣藻的产氢量均降低，转基因藻cc124-hemHc-lbac和cc124-hemHc-lbac
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