热应激对小鼠卵巢颗粒细胞功能及相关基因表达的影响

作     者：罗曼 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王根林

授予年度：2016年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 071007[理学-遗传学] 0836[工学-生物工程] 

主      题：卵巢颗粒细胞 热应激 凋亡 雌二醇 孕酮 促卵泡激素受体 

摘      要：本文研究了热应激对小鼠卵巢氧化指标的影响,并体外培养了小鼠卵巢颗粒细胞,研究了不同温度的热处理对体外培养的小鼠卵巢颗粒细胞凋亡及凋亡相关基因表达量、类固醇激素分泌以及分泌相关基因表达量的影响,并通过检测cAMP含量和FSHR mRNA表达量的变化,探讨FSHR/cAMP/PKA通路是否是热应激的作用通路之一。旨在揭示热对卵巢的作用机制,为进一步研究热应激对雌性动物繁殖性能的影响提供一定的参考依据。1.热应激对小鼠卵巢氧化能力的影响本试验的目的是研究热应激对小鼠卵巢组织氧化能力的影响。热处理:选取36只小鼠随机分成两组,热处理组置于温度42℃、湿度60%的人工气候箱,监测直肠温度,待直肠温度升至4℃时维持30min后取出放回在之前环境中,6h取样。首先测定卵巢组织总氧化能力(T-AOC),谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)活性及反应脂质过氧化水平的丙二醛(MDA)含量。T-AOC和GSH-Px的含量在热应激后显著下降(P0.05)、而MDA含量在热应激后显著升高(P0.05)。以上研究结果表明,热应激会引起雌性小鼠的卵巢氧化损伤。2.热处理对小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响卵巢颗粒细胞是卵巢中的一种关键细胞,若卵巢颗粒细胞发生损伤则卵巢的功能会受到严重影响。本试验研究热处理(40℃热处理和43℃热处理)后体外培养的原代小鼠卵巣颗粒细胞细胞凋亡及凋亡相关基因(caspase-3、Bax、Bcl-2)表达的影响。结果表明,热处理可诱导小鼠卵巢颗粒细胞发生凋亡、caspase-3的高表达以及Bax基因和Bcl-2基因表达量的不同变化。提示热处理会引起卵巢颗粒细胞的凋亡,这可能是热引起卵巢损伤的一个重要原因,并且提示Bax可能有重要影响,而Bcl-2的作用不明显。3.热处理对体外培养的小鼠卵巢颗粒细胞主要类固醇激素的分泌及分泌相关基因表达量的影响卵巢颗粒细胞分泌的类固醇激素主要包括雌激素和孕激素两种激素,在调节卵巢生长发育和卵巢颗粒细胞自身的增殖分化中起主要生理作用的是雌二醇(E2)和孕酮(P4)。雌二醇(E2)和孕酮(P4)能够调控卵巢颗粒细胞自身凋亡,并且在调控卵泡发育和闭锁中具有十分重要的地位,因此雌二醇(E2)和孕酮(P4)分泌水平发生变化会对卵巢的功能产生影响。本试验研究40℃热处理和43℃℃热处理后体外培养的小鼠卵巢颗粒细胞雌二醇(E2)和孕酮(P4)的分泌及分泌相关基因(Star,CYP11A1,CYP19A1)表达量的变化。结果表明热处理使小鼠卵巢颗粒细胞雌二醇(E2)和孕酮(P4)的分泌量降低,43℃热处理后雌二醇(E2)分泌下降显著而40℃热处理后雌二醇(E2)分泌下降不显著,40℃热处理和43℃热处理后孕酮(P4)的分泌均下降显著。显示热处理会影响小鼠卵巢颗粒细胞雌二醇(E2)和孕酮(P4)的分泌,使小鼠卵巢颗粒细胞分泌功能受到损伤,并且这两种主要类固醇激素中的孕酮(P4)可能对热更为敏感。43℃热处理时,分泌相关基因(Star,CYP11A1,CYP19A1)表达量也显著下降。提示热处理会引起卵巢颗粒细胞的雌二醇(E2)和孕酮(P4)分泌降低,且孕酮(P4)的分泌对热更敏感,相关基因(Star,CYP11A1,CYP19A1)表达量下降,这可能也是热引起卵巢损伤原因之一。4.热处理对小鼠卵巢颗粒细胞FSHR/cAMP/PKA通路的影响FSH在雌性动物中功能为刺激卵巢发育,卵泡发育和排卵。其发挥作用必须由FSHR来介导,而卵巢颗粒细胞是卵巢内唯一一类表达FSHR的细胞,因此FSH能够结合卵巢颗粒细胞中的FSHR发挥生理作用。cAMP-PKA通路是细胞内信号转导途径中的一个经典途径,卵巢颗粒细胞中的FSH/cAMP/PKA通路能够优化FSH调控的发挥,是需要重视的一条作用通路。我们推测热处理会对FSH/cAMP/PKA通路造成影响,诱导小鼠卵巢颗粒细胞的凋亡和分泌功能损伤。结果显示,43℃热处理后,小鼠卵巢颗粒细胞分泌的cAMP显著下降(P0.05)并且FSHRmRNA达量显著下降(P0.05),说明FSHR/cAMP/PKA可能是热诱导小鼠卵巢颗粒细胞凋亡和分泌功能损伤的通路之一。