转录因子在棉纤维起始期的表达特征及三个转录因子基因的克隆与功能初步分析

作     者：朱佑民 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郭旺珍

授予年度：2011年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：棉花 纤维发育 逆境胁迫 转录因子 qPCR 亚细胞定位 

摘      要：棉花是世界上最重要的经济作物之一,是纺织工业原材料的重要来源。棉纤维由胚珠外珠被表皮单层细胞发育而来,在整个生长过程中无细胞分裂。因此,棉纤维细胞就成为研究植物细胞分化、细胞形态建成以及细胞壁合成的理想材料。植物在其生长发育过程中,之所以会出现细胞的分化,是因为细胞内各种基因的表达有着时间和空间上的差异,导致这种差异的主要因素之一就是转录因子在转录水平上的调节作用。 我实验室前期以无绒无絮突变体XinWX.无绒有絮突变体XinFLM的-1DPA,0DPA,+1DPA的胚珠为研究材料,基于芯片技术及生物信息学分析,获得一批在纤维起始期差异表达的基因。本研究进一步选择104个转录因子类的差异表达基因,根据芯片差异EST序列信息设计qPCR特异引物,其中81对引物可以获得扩增产物,利用qPCR技术定量验证这类基因在纤维发育早期的表达情况。通过(XinWX, XinFLM两种材料的)qPCR分析验证得到差异基因75个,占总体92.59%。差异基因中与芯片分析的差异基因符合数为56个,符合率为：69.14%。对芯片的验证结果表明,运用基因芯片筛选差异表达基因存在一定的假阳性,但大多数差异表达基因还是稳定和可靠的,为今后进一步研究棉纤维发育功能基因组学奠定了扎实的基础。 从陆地棉中分离了3个转录因子基因,包括2个ZFP类基因和1个AP2/EREBP类基因,分别命名为GhZFP4, GhZFP5和GhAP2/EREBP4. GhZFP4编码属于PLATZC超家族的锌指蛋白,暂时没有发现GhZFP5编码的蛋白的保守域,GhAP2/EREBP4编码属于Polyketide-cyc2超家族的AP2/EREBP蛋白。这3个转录因子的ORF全长分别为663 bp、744 bp和561bp,分别编码220、247和186个氨基酸,蛋白质理论上的等电点和分子量分别为9.12/25.1 kD,8.09/26.3 kD,6.39/21.0 kD。亚细胞定位显示,GhZFP4、GhZFP5和GhAP2/EREBP4均被定位在细胞核上。 选用了4个无绒无絮突变体(新乡小吉无绒无絮突变体XinWX、XZ142WXWX、MD17、SL1-7-1)、2个无绒有絮突变体(新乡小吉无绒有絮XinFLM、N1N1)和一个野生型材料(TM-1)进行棉花纤维初始发育和伸长发育早期转录因子的表达分析。结果发现这3个基因均在根、茎、叶以及纤维发育起始期和纤维伸长期表达量较高。这3个基因在野生型材料与突变体中的表达存在一定差异,GhZFP4和GhZFP5在野生型材料TM-1中的表达低于在突变体MD17,SL1-7-1,XZ142WXWX和N1N1中的表达,可能对纤维发育有抑制作用。GhAP2/EREB P4在XinFLM中的表达高于在XinWX中的表达,可能对纤维发育有促进作用。 采用荧光定量PCR方法检测这3个基因在逆境胁迫(包括干旱、盐、ABA、冷、H202)中的表达情况。结果表明：GhZFP4和GhAP2/EREBP4受***.低温和H202胁迫后表达都比对照组显著升高,但在干旱胁迫下表达水平与对照相比无显著差异;GhZFP5在受干旱、***.低温和H202胁迫后表达都比对照组显著升高。这3个基因可能在棉花的非生物胁迫中起作用。