大肠杆菌O157:H7鞭毛蛋白和溶菌酶抑制剂蛋白的抗原表位验证

作     者：林敏玲 

作者单位：广西大学 

学位级别：硕士

导师姓名：胡庭俊

授予年度：2016年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：肠出血大肠杆菌O157:H7 鞭毛蛋白 溶菌酶抑制剂 抗原表位 

摘      要：肠出血大肠杆菌O157：H7是一种可由食品和水源传播的致病性强的人畜共患传染病原体,从首次分离以来,世界各地出现不同规模的暴发及散发流行,造成养殖业重大经济损失,并时刻威胁着人类的健康。肠出血大肠杆菌O157：H7由于感染程度不同,可导致患者血性腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒症及血栓性血小板减少性紫癜,甚至死亡。世界卫生组织已将其与艾滋病、埃博拉出血热列为新兴传染病。鞭毛蛋白(Flagellin,Flic)和溶菌酶抑制剂(Lysozyme inhibitor, Ivy)都已被证实是肠出血大肠杆菌O157：H7初期粘附和定植的重要毒力因子。本研究首先分析鞭毛蛋白和溶菌酶抑制剂的氨基酸二级结构、亲水性、柔韧性、抗原性、表面性等信息,综合考虑筛选出潜在的细胞抗原表位肽段,并且通过生物合成法合成得到高纯度片段：Flic 338-349 KAASEGSDGASL、Flic460-471 ATDTNKDYAPAI、Ivy 146-157 SLENHPDGFNFK。通过乳化多肽免疫小鼠得到多克隆抗体,运用ELISA、 Western blot、间接免疫荧光试验验证多克隆抗体的滴度、反应性、特异性。经过三次免疫后ELISA测得Anti-Flic338-349、Anti-Flic460-471. Anti-Ivy146-157、Anti-EHEC O157:H7多克隆抗体效价分别为1：1600、1：6400、1：6400、1：12800,结果表明多克隆抗体具有较高效价。Western blot证实制备的多克隆抗体可以识别天然蛋白,存在较高特异性;间接免疫荧光试验结果显示出Anti-Flic338-349、Anti-Flic460-471在Hela细胞外围有绿色荧光;Anti-Ivy146-157在Hela细胞细胞质中强烈的绿色荧光;Anti-EHECO157：H7在Hela细胞胞质与外围均显示绿色荧光;Anti-Flic338-349、 Anti-Flic460-471、Anti-Ivy146-157、Anti-EHEC 0157:H7的荧光强度值是正常对照组的2-4倍,与正常对照存在显著差异(p0.05);说明多克隆抗体的反应性良好。抗体阻断抑制试验首先将Anti-Flic338-349、Anti-Flic460-471、 Anti-Ivy146-157、Anti-EHEC O157:H7多克隆抗体与大肠杆菌O157：H7预处理后,大肠杆菌O157：H7粘附Hela细胞的能力减弱或丧失,荧光强度比无预处理的降低2-3倍,具有统计学差异,表明多克隆抗体可以与大肠杆菌O157：H7天然的蛋白结合,在体外成功阻断大肠杆菌O157：H7对Hela细胞的粘附。多肽免疫后7天攻毒半数致死量(2.81×109CFU)的大肠杆菌O157：H7,攻毒后7天免疫组和攻毒组都在排菌,但攻毒第7天Flic338-349组、Flic460-471组、Ivy146-157组、全菌免疫组小鼠的粪便排菌量明显低于攻毒组,免疫组小鼠临床症状能快速恢复,Flic338-349组、Ivyl46-157组、Flic460-471组、全菌组小鼠保护率分别为80%、90%、100%、100%,攻毒组小鼠保护率仅为30%,且攻毒后7天Flic460-471组、Flic338-349组、Ivy146-157组、全菌组的ELISA抗体水平分别为1：12800、1：1600、1：12800、1：51200,表明多克隆抗体能在体内与大肠杆菌O157：H7进行中和反应,对小鼠感染大肠杆菌O157：H7提供一定的保护力。免疫后攻毒,小鼠脾淋巴细胞的增殖明显,Flic338-349组、Flic460-471组、Ivy146-157组脾淋巴细胞的细胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ的三免和攻毒7天以及IL-6、TNF-α的攻毒后7天细胞因子分泌和mRNA的转录水平显著升高(p0.05),研究结果表明Flic338-349、Flic460-471、Ivy146-157多肽可以增强IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α介导的细胞免疫和IL-12介导的体液免疫,表明小鼠脾淋巴细胞的细胞免疫反应被多肽所激活。综合整个实验结果显示筛选的大肠杆菌O157：H7鞭毛蛋白多肽Flic460-471、Flic338-349和溶菌酶抑制剂多肽Ivy146-157刺激机体产生的多克隆抗体能够识别肠出血大肠杆菌O157：H7天然蛋白,成功抑制肠出血大肠杆菌O157：H7对Hela细胞的粘附,对小鼠感染大肠杆菌O157：H7具有一定的保护力度,并且可以诱导IL-2、IL-6、IL-12、IFN-γ、TNF-α细胞因子的分泌,表明Flic460-471、Flic338-349和Ivy146-157多肽片段具有刺激机体产