非编码基因MALAT1调控结直肠癌转移的机制研究

作     者：杨敏慧 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李祖国

授予年度：2010年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：MALAT1 结直肠癌转移 靶基因 RNA interference RNA activation 实时荧光定量PCR 蛋白质组学 生物信息学预测 APAK-9 

摘      要：随着基因组计划的完成,以及蛋白质组学和转录组学的蓬勃开展,促使RNA组学研究日趋成熟,人类基因组的非编码组分非编码RNA (noncoding RNA, ncRNA)在生命过程中所发挥的不可忽视的重要作用已经逐步的到了广泛的重视和认可。通常,基因组研究集中在对基因组序列中开放读码框的注释和功能划定,然而在真核细胞中,仅有一小部分组分是基因组编码蛋白质的氨基酸序列信息,未知功能的非编码序列占人类基因组的98%,在调节基因表达中起着极为重要的作用。ncRNA被认为,在所有真核细胞调节中起着关键作用,可能具有参与转录调控、DNA复制、染色体配对和染色体凝集等作用。目前研究新获得的数据显示,有一大类功能性RNA分子或隐藏在蛋白质编码区之间或位于编码蛋白质区内,其功能有待进一步阐明。 我们在结直肠癌特异性转移相关基因分析研究中,通过对来源同一亲本具有不同转移潜能结直肠癌细胞系进行表达谱芯片分析,发现在上调表达的298个基因,其中一个基因就是命名为MALAT 1 (metastasis associated lung adenocarcinoma transcript1, MALAT 1)为非编码RNA基因,属于长非编码RNA类(long noncoding RNA, lncRNA),定位于染色体11q13.1,全长8.7kb,缺乏明确的开放式阅读框,不编码蛋白质。MALAT 1在不同转移能力的结直肠癌细胞系中差异表达,我们推测MALAT 1可能具有对结直肠癌转移相关基因的调控作用,与结直肠癌的转移相关。 为证实我们的假说,本次研究采用原位杂交技术和realtime-PCR检测结直肠癌恶性肿瘤组织、肿瘤转移组织和正常组织,以及9种人结直肠癌细胞株的MALAT 1表达情况,分析MALAT 1与结直肠癌中的表达及其与肿瘤转移性之间的关系;利用RNA沉默技术(RNA interference, RNAi)和RNA激活技术(RNA activation, RNAa)研究MALAT 1基因在结直肠癌增殖、侵袭、转移中的作用,探讨MALAT 1基因表达对结直肠癌细胞生物学特性的影响;最后,利用生物信息学计算方法和蛋白质组学技术,筛查不同转移潜能结直肠癌细胞株的差异表达蛋白,分析鉴定非编码RNA基因MALAT 1调控结直肠癌转移相关基因靶点。 第一部分MALAT 1在结直肠癌组织和细胞中的表达 通过原位杂交技术,RT-PCR和realtime-PCR技术分别检测结直肠癌组织、转移癌组织和正常组织以及9种人结直肠癌细胞株MALAT 1的表达情况。在细胞水平：RT-PCR产物电泳图灰度分析显示：低转移潜能大肠癌细胞组MALAT1平均灰度值低于高转移潜能大肠癌细胞组,差异显著(t=-8.514,P0.001),各细胞株组间灰度值具有显著差异(F=106.751, P0.001);LSD检验结果显示：与Caco-2细胞相比,COLO-205、LoVo和SW620细胞MALAT 1表达量较高,SW480/M5、HT29和HCT1 16中等量表达,SW480表达量较低差异显著(P0.05);LS174 T细胞株表达量最低。realtime-PCR检测结果显示：结直肠癌高转移潜能细胞株MALAT 1表达量高于低转移潜能细胞株,差异显著(t=-7.189,P0.001),结直肠癌细胞间MALAT 1基因表达差异显著(F=1045.526P0.01);Dunnett T3检验结果显示：与大肠癌低转移潜能细胞株LS174 T相比,MALAT 1在COLO 205、LOVO、SW620和SW480／M5表达量较高(P0.05);HT29、SW480和HCT116中表达量较低;原位杂交结果显示：高转移潜能细胞株的阳性评分高于低转移潜能细胞组,差异显著(χ2=8.586,P0.05),MALAT 1阳性信号定位于结直肠癌细胞核,各细胞组间统计分析差异显著(χ2=11.913,P=0.036),与LS174 T细胞相比,高转移潜能细胞株SW620和LoVo中MALAT 1表达量较高,差异显著(P0.05)。三种方法检测结果较为一致：高转移潜能细胞株中,MALAT 1表达量明显高于低转移潜能细胞株,其中以COLO 205和LoVo细胞MALAT 1表达量最高,而SW480和LS174 T表达量最低。 在组织水平：RT-PCR产物电泳图灰度分析结果显示：结直肠癌组织中MALAT 1基因表达间差异显著(F=99.784,P0.001);其中淋巴结转移癌和结直肠癌组织中MALAT 1表达量高于正常大肠黏膜组织,有显著差异(P0.01);进行realtime-PCR反应结果显示：结直肠癌组织中MALAT 1基因表达组间差