马尾松银松素合酶基因克隆及其上游调控区的研究

作     者：王冰梅 

作者单位：福建师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈由强

授予年度：2006年

学科分类：0710[理学-生物学] 0907[农学-林学] 07[理学] 08[工学] 0829[工学-林业工程] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：马尾松 银松素合酶 基因克隆 染色体步行 启动子分析 

摘      要：银松素合酶(pinosylvin synthase，PS)是合成银松素类植物抗毒素的关键酶，以肉桂酰辅酶A为底物催化合成银松素。 本文以马尾松(Pinus massoniana)为材料，通过RT—PCR，从马尾松总RNA中，克隆PS的全长cDNA片段(PSR)。测序结果表明，开放读码框(ORF)编码一个由393个氨基酸组成的PS蛋白，其cDNA序列与GenBank数据库中PS基因核苷酸序列的同源性从98％到82％不等。以CaMV35S为启动子，NOS为终止子，构建了PS基因的植物表达载体。通过农杆菌介导的方法转化模式植物烟草，用于研究PS基因在植物内的表达情况。 另外，利用PCR的方法，从马尾松基因组DNA中，克隆PS基因的gDNA，获得长1667bp(PSD1)和1349bp(PSD2)的基因全长序列。序列分析表明，二者是内含子不同的PS基因家族成员，均含有2个外显子和1个内含子，2个外显子均分别为184bp和998bp，内含子分别为481bp和163bp。 此外，利用连接介导的染色体步行技术，克隆了全长1768bp的马尾松PS基因上游调控序列。结果表明，该序列可能存在1个TATA-box、1个CAAT-box.、2个GATA-box和1个GAGA-box、1个G-box以及3个类似activator P of flavonoid biosynthetic genes和若干个TGAC-like序列等顺式作用元件。通过PCR扩增技术，将上游调控区从5′端分别缺失0bp、350bp、775bp、1051bp片段，与GUS报告基因连接，构建了四个双元植物表达载体。这些为今后对PS基因调控区结构和功能的分析奠定了基础。