PTD-Foxp3融合蛋白体外功能的初步研究

作     者：季宝菊 

作者单位：江苏大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邵启祥

授予年度：2010年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：PTD Foxp3 免疫抑制 

摘      要：Foxp3是FOX(forkhead box)家族转录因子中的一员,是调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)的特异性标志,同时在Treg的发生、发育、功能的维持与发挥方面起着关键作用。研究发现表达外源性Foxp3可使非Treg细胞具有类似Treg细胞样的表型及免疫抑制功能。 人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)基因编码的反式激活蛋白(Trans-activator transcription,TAT)中的蛋白转导结构域(protein transduction domain,PTD)能够高效、快速地携带外源性蛋白穿入几乎所有的真核细胞,而进入细胞浆。由于其具有核定位信号,因此也能进入细胞核内。同时PTD具有不影响其携带的目的蛋白功能的特点。 目的:我们的研究是要利用生物大分子载体工具蛋白转导结构域(PTD)将Foxp3蛋白带到细胞内,以获取大量的免疫抑制细胞,从而突破Treg制约基础和临床器官移植的研究瓶颈,为最终应用于器官移植和自身免疫性疾病治疗奠定基础。 方法:流式细胞术检测PTD融合蛋白穿过细胞膜进入EL-4细胞中的能力和量效关系;Western Blot分析和激光共聚焦显微镜观察确认融合蛋白进入细胞浆和细胞核;采用CCK-8法检测融合蛋白对DO11.10鼠的CD4CD25 T细胞活化增殖的影响,以及蛋白转导的CD4CD25 T细胞对效应细胞的增殖抑制能力;RT-PCR检测IL-2、INF-γ、IL-10、TGF-β和CTLA-4的mRNA表达水平;EHSA测定上清中IL-2、INF-γ、IL-10和TGF-β的分泌水平。 结果:通过流式细胞术分析证实表达的PTD-eGFP-Foxp3融合蛋白能高效的转入细胞内;经Western Blot和激光共聚焦显微镜观察确认PTD-Foxp3和PTD-eGFP-Foxp3融合蛋白能够进入细胞浆和细胞核;同时经细胞增殖抑制实验证明PTD-Foxp3融合蛋白能明显抑制OVA特异性TCR转基因小鼠DO11.10小鼠来源的CD4CD25 T细胞的活化增殖能力,并且PTD-Foxp3转导的DO11.10小鼠CD4CD25 T细胞也有抑制细胞活化的能力;RT-PCR和ELISA结果可以看出PTD-Foxp3与Foxp3、PTD-eGFP相比可以明显的抑制效应细胞分泌的IL-2、IFN-γ,并促进抑制性因子IL-10的产生;RT-PCR检测PTD-Foxp3转导的D011.10小鼠CD4CD25 T细胞,证实表面标志分子CTLA-4的表达有所升高。 结论:PTD-Foxp3具有调节CD4CD25 T细胞的作用,并且有可能将CD4CD25 T细胞转化为Treg样细胞,希望能应用于自身免疫性疾病和抗器官移植排斥反应的治疗中。