水产品中亚甲基蓝及其代谢物多残留检测方法的研究

作     者：范克伟 

作者单位：福建农林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吴德峰;杨方

授予年度：2009年

学科分类：0906[农学-兽医学] 09[农学] 

主      题：亚甲基蓝 天青A 天青B 天青C 水产品 液相色谱法 液相色谱串联质谱联用法 

摘      要：亚甲基蓝属噻嗪类染料,在兽医中主要用作消毒剂与解毒剂。由于其对防治淡水鱼的水霉病、红嘴病、小瓜虫病等都有很好的疗效,自从孔雀石绿、结晶紫等三苯甲烷类染料被禁用于水产养殖后,亚甲基蓝成了一种较好的替代品。由于研究发现这种染料及代谢物有致畸作用,且在日本与美国,并未允许用于水产养殖,其在水产品中的残留受到广泛重视。目前有关亚甲基蓝检测方法包括分光光度法、液相色谱法及毛细管电泳等,主要针对亚甲基蓝原药,同时检测水产品中亚甲基蓝及其代谢物天青A,天青B,天青C残留的文献未见报道。因此,有必要对水产品中亚甲基蓝及代谢物的检测进行研究。 本文对高效液相色谱法和超高效液相色谱-质谱联用法测定水产品中亚甲基蓝及其代谢物进行了研究和比较。高效液相色谱法的检出限为2.0μg/kg。但其不能够定性被测物质,往往会因为阳性物质的误认导致定量测定存在误差。液质联用法的检出限是1.0μg/kg。其质谱检测器的灵敏度相比较高效液相的检测器的高,可以大大的提高检测的稳定性、准确性、重现性、检出限。 首先,比较了不同的还原剂以及酸碱对亚甲基蓝稳定性的影响,发现无色亚甲基蓝常温下就比较容易被氧化为亚甲基蓝,亚甲基蓝在酸性条件下相对稳定。同时,还比较了不同的温度条件、不同的加热时间等对人工投药白鲫鱼及小白鼠样品中亚甲基蓝及其代谢物稳定性的影响,发现样品中先加入5mL对甲苯磺酸-乙酸铵缓冲溶液(PH3.0)70℃恒温水浴加热15min,再按原方法进行处理可以明显提高亚甲基蓝的回收率。 其次,对高效液相色谱仪的检测波长、色谱柱、流动相等仪器条件,以及液相色谱质谱联用仪的色谱柱、柱温、流动相、梯度洗脱条件、质谱参数等仪器条件进行了优化,使仪器达到最佳状态。 在优化样品前处理条件方面,通过比较不同提取剂和不同提取方法等的提取效果,确定了乙腈-对甲苯磺酸-乙酸铵缓冲溶液为提取溶液,样品匀浆3min后,在温度70℃超声15 min的提取方法,提取液经正己烷除脂,二氯甲烷反提取,Supelco DSC-MCAX固相萃取小柱提纯与净化,优化了洗脱液,讨论了有无过膜的影响;在高效液相色谱法分别对空白活鳗、黄鱼、虾样品进行了0.005、0.020和0.50mg/kg 3个水平加标回收试验,方法回收率在75.9%～93.2%之间,相对标准偏差为3.33%～11.86%,方法检出限为2.0μg/kg,符合组织样品处理的真实度和精密度;对于液相色谱质谱联用方法分别对空白活鳗、烤鳗、黄鱼、虾样品在1.0、2.0、4.0、10.0μg/kg 4个不同浓度水平上分别进行加标回收实验,方法回收率为75.58%-101.26%,相对标准差为3.02%-12.27%,方法检出限为1.0ug/kg,说明该法精密度好、稳定可靠。 最后,对人工投药白鲫鱼和小白鼠样品进行检测分析,阳性率几乎达100%,验证了方法的实用性。