CMV芭蕉分离物全基因组序列与侵染性克隆研究

作     者：覃佐东 

作者单位：浙江理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈集双

授予年度：2010年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：黄瓜花叶病毒 芭蕉 基因组序列 非编码区 侵染性克隆 

摘      要：黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)为典型的+ssRNA病毒,其基因组分布于3条RNA,结构相对简单,通过突变、重组和假重组进行变异和进化,以适应新的环境和寄主。该病毒是研究RNA病毒变异的重要模式病毒。目前,根据CMV编码的基因序列和末端结构差异将其分为亚组I(IA和IB)和亚组II。亚组I和亚组II株系存在明显的寄主分布差异。 本研究从杭州自然感病的芭蕉(Musa basjoo)样品中检测到一株CMV,通过感病叶组织dsRNA提取、RT-PCR扩增和克隆测序,首次获得了侵染该种植物CMV种内纯合体亚组II株系的全基因组序列,并命名为CMV-Mb。CMV-Mb RNA1部分序列(1381nt)以及RNA2(3034nt)和RNA3(2189nt)全序列分析结果表明:其RNA1 5 端的1381nt部分序列包含CMV 1a ORF,后者编码460个氨基酸的1a蛋白(119-1500);CMV-Mb RNA2全长为3034nt,其2a ORF(86-2659)编码858个氨基酸的2a蛋白;2b ORF(2418-2750)的5 端与2a ORF的3 端重叠,编码111个氨基酸的2b蛋白;CMV-Mb RNA3全长2189nt,内含两个ORF,其中3a ORF(97-936)编码280个氨基酸的3a蛋白,CP ORF(1229-1885)编码219个氨基酸的CP。CMV-Mb RNA1与国外报道的亚组II CMV-Q株系、中国内地分离物(CMV-Tsh和CMV-Tagetes erecta)的核苷酸序列同源性分别为96.0%和97.0%。CMV-Mb RNA2与亚组IA、IB分离物CMV-Fny和CMV-Sd的核苷酸序列同源性均为85.0%,而与亚组II CMV-Q序列同源性达97.0%。CMV-Mb 2b的核苷酸序列与亚组IA、IB的同源性低于50.0%,但与亚组II CMV-Q株系的序列同源性为96.0%。CMV-Mb RNA3与CMV-Q的核苷酸序列同源性达97.0%;与CMV-Q 3a和CP核苷酸同源性分别为98.0%和99.0%,与CMV-Fny和CMV-Sd的同源性分别为85.0%、78.0%和83.0%、78.0%。分析结果表明CMV-Mb基因组RNA1、RNA2和RNA3均来源于亚组II,其5个ORF的核苷酸序列同源性比较结果与三条基因组比较结果一致。因此,本研究首次报道了一株分离于芭蕉属芭蕉植株的CMV亚组II纯合体全基因组信息。 运用序列比对软件,分析国内外报道的CMV株系RNA3 5′末端序列,发现CMV亚组I和亚组II表现出各自显著的特征,CMV-Mb的序列整体上与亚组II保持一致但发生了12-14nt的碱基缺失。CMV株系RNA3 5′UTR存在天然的突变和碱基缺失,有两个天然的突变区,分别位于8～33 nt和50～63 nt,进化树分析发现其5′UTR成为独立的分枝。本研究首次发现了侵染芭蕉属植株的CMV在RNA3末端序列上存在碱基缺失和突变的自然现象,此现象的发生可能与自然环境和寄主对病毒的选择有关,也可能与无性繁殖植物的适应性有密切关系。 通过5 端引入T7启动子序列,3 末端引入Pst I酶切位点,运用RT-PCR的方法构建了CMV-Mb RNA3的侵染性克隆,并通过体外转录成功获得了具有侵染活性的CMV-Mb RNA3的转录本。将CMV-Mb RNA3的侵染性转录本与CMV-Fny RNA1和RNA2的侵染性转录本混合后接种心叶烟(Nicotiana glotinosa),得到了人工假重组体F1F2M3,发现CMV人工重组体(F1F2M3)具有系统侵染性。