里氏木霉木聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中高效表达的研究

作     者：仲伟麒 

作者单位：东北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李杰

授予年度：2008年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：里氏木霉 木聚糖酶 基因克隆 毕赤酵母 表达 

摘      要：木聚糖是半纤维素中含量最丰富的一种组分,在植物细胞壁中的含量仅次于纤维素,约占细胞干重的35%。它的存在使谷物中的营养物质不能被充分暴露于动物消化液的表面,进而影响动物的消化吸收,降低了饲料的营养价值。 木聚糖酶(1,4-β-D-xylan xylanohydrlase,EC 3.***.1.8)通过内切方式水解木聚糖分子中的β-1,4-木糖苷键,水解产物以木寡糖和木二糖为主。随着木聚糖酶在造纸、食品、饲料等领域的成功应用,它已成为酶制剂产业的一个重要产品,在生物转化、食品、饲料、医药、能源、造纸、纺织等行业中有着广泛的应用前景,具有很大的商业开发价值。但是目前传统的木聚糖酶生产方法产量较低,限制了其广泛应用,应用基因工程技术可望解决这一问题。 本研究以里氏木霉(Trichoderma reesei)QM9414菌株为基因供体,克隆木聚糖酶基因xyn2,分别构建其大肠杆菌表达载体和酵母表达载体,并分别转到大肠杆菌和毕赤酵母中。进一步对表达的木聚糖酶进行酶学分析,为大规模工业生产和应用奠定基础。 主要研究结果如下: 以木聚糖为诱导剂诱导里氏木霉表达木聚糖酶,确定了最佳诱导时间为72小时,标准状态下最大酶活为6.32IU/ml。里氏木霉木聚糖酶最适pH值为4.0,最适温度为50℃。 采用RT-PCR方法克隆到了里氏木霉木聚糖酶基因xyn2。测序得到xyn2基因的序列与GeneBank上编号为U24191的xyn2基因序列完全相同。采用PCR法,以里氏木霉DNA为模板克隆了里氏木霉木聚糖酶基因。测序得到xyn2基因的DNA序列,与xyn2基因的cDNA序列进行了比对,确定了xyn2基因含有一个内含子。 构建了xyn2基因的大肠杆菌表达载体pEK1。将pEK1转化至大肠杆菌BL21中,进行诱导表达。IPTG诱导5小时,标准状态下最大酶活为42.28IU/ml。对表达的木聚糖酶性质进行了分析,确定最适pH值为6.5,最适温度为45℃。 构建了xyn2基因毕赤酵母表达载体pPIC9-xyn2。摇瓶培养96h标准状态下最大酶活为208.12IU/ml,比出发菌株酶活提高了约33倍。对重组木聚糖酶性质进行了分析,确定最适pH值为5.0,最适温度为55℃。