中空纤维细胞捕获及中空纤维液相微萃取—高效液相色谱法研究茵陈蒿汤中的主要抗癌活性成分

作     者：武迪 

作者单位：山西医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：白小红

授予年度：2018年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 070302[理学-分析化学] 0703[理学-化学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：中空纤维细胞捕获 中空纤维液相微萃取 高效液相色谱法 茵陈蒿汤 抗癌活性成分 

摘      要：目的:以中空纤维为载体,建立基于肝癌HepG-2细胞和肾癌ACHN细胞的中空纤维细胞捕获-高效液相色谱法(Hollow fiber cell fishing-HPLC,HFCF-HPLC)及中空纤维液相微萃取-高效液相色谱法(Hollow fiber liquid phase microextraction-HPLC,HFLPME-HPLC),并利用这两种方法对中药复方茵陈蒿汤及组成茵陈蒿汤的单味茵陈、栀子、大黄进行体内外活性成分筛选、检测及其药代动力学研究。方法:在考察了HepG-2细胞和ACHN细胞在纤维内壁生长状况、筛选前后细胞活性及筛选结果重现性的基础上,将种有HepG-2细胞和ACHN细胞的中空纤维同时插入中药样品或灌胃茵陈蒿汤复方后的大鼠生物样品中,筛选其中的主要活性成分,并通过HPLC分离、鉴定筛选出的活性成分。同时,分析并比较了主要活性成分与细胞的结合能力、活性成分之间的协同或拮抗作用。在对HFLPME-HPLC进行条件优化、方法学考察的基础上,将充满庚醇的中空纤维插入中药复方茵陈蒿汤样品溶液或其生物样品溶液中,对其中的主要活性成分进行富集、浓缩和萃取,并结合HPLC测定其在中药中的含量、SD大鼠体内的分布及药动学参数,初步探讨茵陈蒿汤抗肝癌和肾癌的有效成分。结果:本研究基于HFCF-HPLC和HFLPME-HPLC:(1)筛选出的茵陈蒿汤中的主要抗癌活性成分为绿原酸、栀子苷、对羟基苯乙酮、西红花苷和大黄酸,其含量分别为0.41±0.03、3.02±0.16、0.01±0.00、0.20±0.01、0.06±0.00 mg/g。(2)SD大鼠灌胃茵陈蒿汤30 min后,绿原酸、栀子苷和大黄酸可以吸收入血并与癌细胞发生相互作用,且栀子苷和大黄酸可以到达肝脏并作用于HepG-2细胞(CFFHepG-2 8.4、CFFHepG-2 4.7),绿原酸和大黄酸可以到达肾脏并作用于ACHN细胞(CFFACHN 0.2、CFFACHN 2.1)。(3)经DAS 2.0软件非房室模型计算,对羟基苯乙酮、西红花苷和大黄酸的主要药动学参数C为0.35±0.06、0.78±0.07、2.95±0.76μg/m L,t为27.59±12.24、2.48±0.31、0.39±0.06 h,AUC0-∞为11.09±3.41、2.90±0.26、2.24±0.58 h·μg/m L。结论:(1)体外研究发现,茵陈蒿汤中主要体外抗癌成分可能为绿原酸、栀子苷、对羟基苯乙酮、西红花苷和大黄酸。且与单味药相比,茵陈蒿汤复方中活性成分的种类更多、与癌细胞的结合能力更强,其中栀子苷、西红花苷和大黄酸具有明显的协同效应。(2)体内研究表明,绿原酸、栀子苷和大黄酸可以吸收入血,到达肝脏或肾脏并作用于相应癌细胞,提示茵陈蒿汤中抗肝癌的主要有效成分可能是是栀子苷和大黄酸,抗肾癌的主要有效成分可能是绿原酸和大黄酸。(3)茵陈蒿汤中主要抗癌有效成分具有多成分、多靶点的作用特点,且抗癌活性与其在中药中的含量或血药浓度无关。总之,HFCF-HPLC是一种可靠、简单、快速的中药活性成分筛选方法,HFLPME-HPLC是一种净化能力强、灵敏度高的中药活性成分检测方法。二者结合成功的用于茵陈蒿汤体内外抗肝癌、肾癌主要活性成分的筛选及药动学研究。本研究的结果为阐明茵陈蒿汤中抗肝癌、肾癌有效成分及其药效物质基础、发现茵陈蒿汤新的临床应用及建立茵陈蒿汤个性化质量控制标准提供了思路和实验基础。