黄颡鱼TLR18、TLR19和TLR21基因的克隆及表达分析
作者单位：华中农业大学
学位级别：硕士
导师姓名：魏开建
授予年度：2017年
主 题：黄颡鱼 TOLL样受体 TLR18 TLR19 TLR21 cDNA克隆 基因表达 免疫刺激 原核表达
摘 要：黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)是我国淡水养殖的优良品种,近些年由于大规模和高密度的养殖,其在养殖过程中极易受到细菌性疾病的危害,对黄颡鱼健康养殖造成了严重的影响。TOLL样受体作为模式识别受体家族成员之一,通过识别微生物表面的病原相关分子模式,从而介导细胞信号向下游传递,最终会活化转录因子,促进前炎症因子的释放,从而发挥免疫作用。对黄颡鱼TOLL样受体基因分子特征以及免疫应答反应进行研究,探讨其在先天性免疫中的潜在功能,对黄颡鱼疾病控制具有重要的意义。为此,本研究以TOLL样受体转录组数据为基础,克隆黄颡鱼PfLR18、PfLR19及PfLR21基因并进行序列分析。采用荧光定量PC R对PfLR18、PfLR19和PfLR21基因在黄颡鱼各组织以及早期胚胎发育过程中的时空表达进行研究,检测灭活嗜水气单胞菌感染前后3个TLR基因在5个免疫组织中转录水平的变化,以及脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)和聚胞肌苷酸(Poly(I:C))刺激前后3个TLR基因在黄颡鱼外周血淋巴细胞中转录水平的变化。取得的主要研究结果如下:1.黄颡鱼PfLR18、PfLR19和PfLR21基因cDNA序列的克隆和分析黄颡鱼PfLR18的部分cDNA序列长2254 bp,包含1956 bp的编码区,298 bp的3’非翻译区(UTR),编码651个氨基酸。黄颡鱼PfLR19的部分c DNA序列长2948 bp,包含2262 bp的编码区,418 bp的3’UTR,编码753个氨基酸。黄颡鱼PfLR21的cDNA序列全长3492 bp,包含206 bp的5’UTR,2799 bp的编码区和487 bp的3’UTR,编码931个氨基酸。经BLAST比对和系统进化树分析,黄颡鱼PfLR18、PfLR19和PfLR21基因的核苷酸和氨基酸序列均与斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)相似性最高,亲缘关系最近。2.黄颡鱼PfLR18、PfLR19和PfLR21 mRNA在成体组织和早期发育阶段的表达PfLR18、PfLR19和PfLR21 mRNA在黄颡鱼成鱼14个被检测的组织中均有表达,其中脾脏最高,头肾和血液适中,其余较低。黄颡鱼PfLR18、PfLR19和PfLR21 mRNA在早期发育阶段均有表达。从受精卵到囊胚晚期处在一个很高的表达水平,表达量明显高于其它胚胎发育阶段。出膜后,这三个基因的表达量明显呈现出不同程度的上调趋势。3.灭活嗜水气单胞菌刺激前后黄颡鱼PfLR18、PfLR19和PfLR21mRNA在5个免疫相关组织中表达的变化免疫刺激后,PfLR18、PfLR19和PfLR21 mRNA在脾脏、头肾、中肾、肝脏和血液中均显著上调。黄颡鱼PfLR18最早(12 h)在肝脏中达到峰值。在头肾和中肾中,PfLR18 mRNA在刺激后6 h至48 h内均处在一个较高的表达水平,并分别在48 h和24 h达到峰值。在脾脏中,PfLR18 mRNA表达水平在刺激后12 h至120 h显著上调,72 h后达到峰值。在头肾和中肾中,PfLR19在刺激后24 h至48 h明显上调,48 h后达到最高。在脾脏和肝脏中,PfLR19 mRNA在刺激后均出现少量的下调,但在72 h之后又迅速上升,168 h后达到峰值。在脾脏和肝脏中,黄颡鱼PfLR21 mRNA在刺激后72 h之内基本保持恒定或少量下调,但其在刺激后120 h迅速上调并在此时间点达到峰值。在头肾和中肾中,PfLR21 mRNA分别在免疫后24 h和48 h达到峰值。在血液中,PfLR21 mRNA表达量变化与PfLR18和PfLR19基因相似,它们均在刺激后72 h呈现出显著上调的趋势并在168 h达到峰值。***、PGN和Poly(I:C)刺激后PfLR18、PfLR19和PfLR21 mRNA在黄颡鱼血液淋巴细胞中表达量的变化在经过LPS、PGN和Poly(I:C)刺激后,黄颡鱼PfLR18、PfLR19和PfLR21 mRN A的表达量均在3 h呈现出显著的上调。经过LPS刺激后,三个基因的表达量在3 h到12 h都保持在一个较高的水平,尽管在6 h有小幅的下降;经过PGN刺激后的3 h呈现出最高的表达水平,之后虽有所下降但依然保持在一个较高水平,在12 h表现为稍高于对照组的水平;经过Poly(I:C)刺激后,它们均在3 h到6 h持续上调,并且在6 h达到最大值,后又在12 h恢复到对照组水平。5.黄颡鱼PfLR18、PfLR19和PfLR21胞外区原核表达成功构建黄颡鱼PfLR18、PfLR19和PfLR21基因胞外区序列重组表达载体,经大肠杆菌BL21(DE3)表达系统成功表达出融合蛋白。可溶性检测发现pGEX-LRR18、pGEX-LRR19和p
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