平菇漆酶基因生物信息学分析和杂优-2平菇漆酶分离纯化及酶学性质、功能基团研究

作     者：廖海君 

作者单位：西南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：唐云明

授予年度：2017年

学科分类：0831[工学-生物医学工程（可授工学、理学、医学学位）] 0711[理学-系统科学] 07[理学] 08[工学] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：漆酶 生物信息学 杂优-2平菇 分离纯化 酶学性质 功能基团 

摘      要：漆酶(laccase)是一种铜多酚氧化酶,是木质素降解酶系之一,在食用菌栽培过程中,漆酶对菌丝体扭结具有促进作用,能够形成较多的子实体原基,进而提高食用菌的产量,且在工业染料废水处理等方面有重要作用。依据平菇基因组数据,真菌木质素降解酶的编码基因能在基因组水平上得到统计和注释。但是,目前也存在一些亟待解决的问题,如功能基因注释结果的不准确性、漆酶基因转录调控机理不清楚等。本文通过对平菇漆酶的11条基因序列及其推断氨基酸序列进行生物信息学分析,为研究漆酶基因的调控机理、功能基因组及为本文实验提供理论指导。同时,本实验选用尚未报道的杂优-2平菇为实验材料,从中分离纯化出漆酶并对其理化性质进行研究旨在为充分了解杂优-2平菇漆酶的理化性质及对漆酶的进一步研究、食用菌生产和工业应用等方面提供参考。平菇漆酶基因可能受到N源和来自外界压力胁迫调控,但可能不会受到培养基中葡萄糖浓度的影响,除LACC12外,其余漆酶基因可能会共同响应高浓度的铜离子的压力而激活平菇漆酶基因的转录;杂优-2平菇漆酶在中性和碱性条件下稳定性较好,但该酶的热稳定性较低。二硫键在维持杂优-2平菇漆酶的空间结构稳定性有重要作用。研究结果如下:1、启动子区域分析结果显示:LACC1-LACC12(LACC5除外)均含有不同的顺式作用元件,包括热激响应元件(HSE)、压力响应元件(STRE)、金属应答元件(MRE)、异生物质反应元件(XRE)、抗氧化响应元件(ARE)、CreA因子结合位点(CreA-bingding site)、氮因子结合位点(NIT),还包括CAAT框(CAAT Box)、TATA框(TATA Box)等核心转录起始位点。对漆酶基因编码区上游2000 bp和下游2000bp区域的限制性酶切位点分析发现:LACC1-LACC12(LACC5除外)的限制性酶切位点数在216范围不等。2、漆酶基因系统进化分析及LACC1-LACC12(LACC5除外)相似性分析结果显示:LACC1与秀珍菇(Pleurotus sajor-caju)的LACC2相似性为99.59%;LACC3与秀珍菇(Pleurotus sajor-caju)的LACC5和凤尾菇(Pleurotus pulmonarius)的LACC7相似性分别为87.90%、87.04%;LACC7与杏鲍菇(Pleurotus eryngii)LACC1相似性为95.96%;LACC10与秀珍菇(Pleurotus sajor-caju)的LACC4相似性为97.93%,11条漆酶基因聚为三支。3、氨基酸序列相似性分析发现:11条推断氨基酸序列聚为4支,在进化关系中,LACC6与LACC8、LACC9与LACC10为一支,亲缘关系最近。氨基酸多序列比对和BLAST及RPS-BLAST结果显示:11条推断氨基酸序列中均有漆酶特征序列L1-L4和3个高度保守的铜氧化酶(Cu-oxidase)结构域;SiganlP4.1及Protcomp9.0结果显示:11推断氨基酸序列中都含信号肽,且都为外分泌蛋白。4、Protparam对11条漆酶推断氨基酸理化性质预测结果显示:AI在83.642.81;ExtCof1和ExtCof2几乎没有差异;除LACC1和LACC10外,其余氨基酸的GRAVY均为负值;II在32.812.04范围内;MW介于55.688.87之间;pI在4.53.78范围;除LACC8外,其余氨基酸的TNNCR均高于TNPCR。5、推断氨基酸理化性质和组成分析结果显示:理化性质分为三簇,ClusterⅠ与ClusterⅢ、ClusterⅡ与ClusterⅢ之间存在显著性差异(P0.05);每个簇内的氨基酸理化性质差异性在三个簇之间无显著性差异(P0.05)。氨基酸组成也分为三簇,ClusterⅠ与ClusterⅡ及ClusterⅢ均有显著性差异(P0.05);ClusterⅠ、ClusterⅡ、ClusterⅢ内的漆酶氨基酸序列组成差异性在三个簇之间无显著差异(P0.05)。6、通过对杂优-2平菇菌丝进行液体培养,发酵液经硫酸铵分级沉淀、DEAE(diethylaminoethyl)-Sepharose fast flow层析和Superdex-200 prep grade层析等方法纯化,获得了电泳纯的杂优-2平菇漆酶。结果显示,培养第6天时漆酶活性最高;杂优-2平菇漆酶比活力为115 U/mg,纯化倍数为111.65,回收率为6.96%。分子质量约为244.0 kD,亚基分子质量约为85.6 kD。最适反应pH值和最适反应温度分别为5.0和55℃,在pH 6.0