炭疽杆菌A16R免疫蛋白质组学的研究

作     者：任静晓 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈福生

授予年度：2010年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：炭疽芽孢杆菌 芽孢蛋白 营养体蛋白 抗原 免疫蛋白质组学 

摘      要：炭疽是由炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis, BA)引起的一种烈性人畜共患传染病。由于炭疽芽孢易于大量培养、极难被杀灭、可通过气溶胶途径传播,并且引起的吸入性肺炭疽死亡率较高等特点,所以长期以来一直被某些国家认为是首选的生物战剂。自美国“911事件发生后,BA研究再次成为世界各国关注的热点。而预防炭疽最有效的方法是疫苗,所以炭疽疫苗的研究成为目前研究的热点,而从BA中筛选具有免疫原性的蛋白质则是疫苗设计的关键。本研究采用蛋白质组学研究方法,大规模筛选BA营养体和芽孢蛋白中可能存在的免疫原性蛋白质,这将为我们深化炭疽芽孢杆菌的认识,以及检测、诊断炭疽芽孢杆菌与对炭疽的早期治疗提供靶标。主要研究结果如下： 以BA A16R菌株为实验菌株,采用固态培养,在含有200 mL的LB固态培养基的罗氏瓶内进行培养,先放于37℃的培养箱内正置一天后,再倒置于30℃培养箱内培养10-15 d,用4℃灭菌纯水清洗培养基表面,8000r／min离心10 min收集芽孢,直至复红美兰染色观察芽孢纯度达到98%为止。然后将收集的芽孢用2 mL的4℃灭菌纯水重悬,稀释涂板计数,得到芽孢浓度为5.5×109CFU／mL。 以收集纯化的芽孢免疫4只新西兰大白兔,首次家兔腹股沟免疫,间隔14d后耳静脉免疫2次,后来采用皮下多点免疫,且免疫相隔7d,共免疫5次,以间接ELISA测定血清效价达到12800。免疫印迹实验验证了,所制备的血清可以与炭疽蛋白发生反应,所以制备出的血清为下一步筛选具有免疫原性的蛋白点提供了材料。 采用超声裂解方法分别制备BAA16R菌株的营养体和芽孢蛋白样品,蛋白样品经双向电泳分离,电转膜后,用上述制备的多克隆抗体进行免疫印迹。然后将双向电泳的考马斯亮蓝染色胶图与免疫印迹曝光图匹配比对,找出匹配的蛋白点后,进行胶内酶切和质谱鉴定。结果表明,BA的营养体蛋白样品中有86个具有免疫原性的蛋白点,BA的芽孢蛋白样品中有13个具有免疫原性的蛋白点。在这些免疫原性的蛋白点中,19种蛋白质在以前的文献中被报导外,其他的蛋白质均未见报道。本研究结果为BA新疫苗的研发提供了新线索。