DOG融合蛋白对缺氧CT26细胞中Notch信号的阻断作用

作     者：何爱丽 

作者单位：苏州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：赵林川

授予年度：2010年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：缺氧 DOG融合蛋白 Notch信号 结肠癌 

摘      要：体外研究表明,缺氧促进肿瘤细胞的侵袭和转移与Notch信号有关。为了探讨结肠癌缺氧区细胞中的Notch信号与肿瘤体内生长的关系,本研究构建了特异性阻断缺氧细胞中Notch信号的DOG融合蛋白表达载体。论文主要涉及以下内容,首先,分别构建了DNMAML1-GFP、ODD-DNMAML1-GFP ( ODG )和DNMAML1-ODD-GFP(DOG)三种不同的融合蛋白表达载体。其次,将上述融合蛋白表达载体转入293T人胚肾细胞,借助荧光显微镜,观察不同融合蛋白在正常氧和缺氧细胞中的表达,发现DOG融合蛋白的稳定存在依赖于缺氧环境。然后,通过逆转录病毒介导DOG融合蛋白在CT26结肠癌细胞中表达,借助荧光显微镜观察荧光强度,应用Western印迹和实时荧光定量PCR(real-time fluorogentic quantitative-PCR, RFQ-PCR)等方法验证DOG融合蛋白对缺氧的依赖性和抑制Notch信号的能力。最终,通过失巢凋亡实验和小鼠体内肿瘤形成实验,探讨了DOG融合蛋白对CT26结肠癌细胞的生物学作用。 1.成功构建了DNMAML1-GFP、ODG和DOG三种不同的融合蛋白表达载体 酶切和测序结果表明,构建DNMAML1-GFP、ODG和DOG三种不同的融合蛋白表达载体获得成功。 ***融合蛋白在缺氧的293T细胞中表达增强 因为DNMAML1、ODD和GFP为融合蛋白,故293T细胞中绿色荧光的强弱可以初步反映融合蛋白表达量的多少。荧光显微镜下观察DNMAML1-GFP、DOG、ODG三种融合蛋白在正常氧和缺氧细胞中的表达情况,结果发现DOG融合蛋白在缺氧细胞中的表达明显增强。 3.在结肠癌细胞(CT26)中DOG融合蛋白的稳定存在依赖于缺氧条件 成功获得逆转录病毒感染的CT26稳定细胞系(MID-DOG/CT26和MID-GFP/ CT26)。在荧光显微镜下观察,发现DOG融合蛋白的稳定存在依赖于缺氧环境,Western印记法同样表明DOG融合蛋白只在缺氧的CT26细胞中存在。 ***融合蛋白特异性抑制缺氧CT26细胞中的Notch信号 利用RFQ-PCR检测Notch信号下游靶基因Hes1 mRNA的表达水平。与GFP对照相比,DOG融合蛋白对正常CT26细胞中Hes1 mRNA水平无明显影响,该蛋白显著降低缺氧CT26细胞中Hes1 mRNA水平(P 0.01)。上述结果表明,DOG融合蛋白能够特异性抑制缺氧CT26细胞中的Notch信号。 ***融合蛋白促进缺氧的CT26细胞体外的失巢凋亡 与对照相比,DOG融合蛋白对正常CT26细胞的失巢凋亡没有明显影响,却促进缺氧CT26细胞的失巢凋亡(P 0.01)。 ***融合蛋白抑制CT26细胞在BALB/c小鼠体内生长 体内成瘤实验表明,与GFP对照蛋白相比,DOG融合蛋白抑制CT26细胞在小鼠体内成瘤;小鼠接种MID-DOG/CT26细胞21天后,肿瘤组织的质量明显低于MID-GFP/CT26对照组(P 0.01)。 通过上述结果,我们得出以下结论:DOG融合蛋白特异性阻断缺氧CT26细胞中的Notch信号;结肠癌缺氧区细胞中的Notch信号促进肿瘤体内生长。