抗钠—钙交换体α-2840-877单克隆抗体对大鼠心肌主要离子电流的影响及其对缺血/再灌注诱发心律失常的抑制作用研究

作     者：陈依春 

作者单位：山西医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：封启龙

授予年度：2016年

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：钠-钙交换体 单克隆抗体 全细胞膜片钳 离子电流 心律失常 

摘      要：目的:1.制备抗钠-钙交换体(Na+-Ca2+exchanger,NCX)α-2重复序列(840-877)(α-2(840-877))单克隆抗体,观察其对成年大鼠心室肌细胞主要离子电流的影响。2.建立大鼠心肌缺血/再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)诱发的心律失常模型,观察抗NCXα-2(840-877)单克隆抗体对模型大鼠心律失常的影响,并分析其作用机制。方法:1.抗NCXα-2(840-877)单克隆抗体的制备及效价检测。单克隆杂交瘤细胞株由NCXα-2第840-877位氨基酸残基肽段免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合而成,经筛选所得的阳性克隆株及三次亚克隆后获得可以稳定分泌单克隆抗体的细胞株。通过对其进行扩大培养,采用动物体内诱生法制备腹水,应用Protein A亲和柱对所得腹水进行纯化,得到单克隆抗体。利用间接ELISA法检测纯化后的单克隆抗体效价;SDS-PAGE法测定纯化后的单克隆抗体纯度。2.大鼠心室肌细胞急性分离。正常成年SD大鼠用40 mg·kg-1戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,快速开胸取心脏,经主动脉逆行插管将心脏悬挂于Langendorff灌流装置上,以100%氧气充灌的无钙台氏液恒压(7.35 Kpa)、恒温(37℃)灌流心脏10 min,改为酶液循环灌流150 min,待心室变大,变软后剪取心室肌组织置于KB液中剪碎,玻璃吸管轻轻吹打3 min后,过滤得到单个细胞,保存于KB液中,室温下静置3 h让其稳定后进行实验。3.全细胞膜片钳记录。应用全细胞膜片钳技术,在电压钳模式下记录大鼠单个心室肌细胞Na+/Ca2+交换电流(INa/Ca),L-型钙电流(ICa-L),内向整流钾电流(IK1),瞬时外向钾电流(Ito),钠电流(INa)。4.大鼠离体和在体缺血/再灌注(I/R)诱发心律失常模型的建立。(1)大鼠离体缺血/再灌注诱发心律失常模型。SD大鼠用40 mg·kg-1戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,开胸离体心脏后,悬挂于Langendorff灌流装置上经主动脉逆行灌流,记录心电图,待心脏收缩稳定后,结扎冠状动脉左前降支,造成局部缺血30 min,松扎后再灌注30 min。分别累计缺血后30 min和再灌注后30 min内期前收缩个数,室速的发生率、持续时间,室颤的发生率、持续时间。(2)大鼠在体心脏缺血/再灌注诱发心律失常模型。SD大鼠用10%水合氯醛(30 mg·kg-1)腹腔注射麻醉,开胸,采用BL-420F生物机能实验系统记录大鼠Ⅱ导联心电图,结扎冠脉左前降支,局部缺血15 min,松扎后再灌注15 min。抗NCXα-2(840-877)-2D2抗体、抗NCXα-2(840-877)-3F10抗体(50μg·kg-1),利多卡因(Lidocaine,7.5 mg·kg-1)分别于缺血前或再灌注前3 min尾静脉注射,观察期前收缩个数、室速的发生率、持续时间,室颤的发生率、持续时间。5.心肌细胞钙瞬变测定。将酶解法分离好的成年大鼠心室肌细胞制成细胞悬液,负载5μmol·L-1荧光染料Fura2-AM,避光孵育30 min,重复清洗三次。离子影像分析系统仪器预热后,将负载有荧光染料的细胞制成细胞悬液,在细胞槽内贴壁10 min,用台氏液持续灌流,流速约1 ml·min-1,用10 V电压以0.5 Hz频率给予场刺激触发细胞收缩,在高倍镜下选取纹理清晰,随刺激稳定收缩的心室肌细胞作为观察对象,应用离子影像分析系统记录钙瞬变。结果:1.抗NCXα-2(840-877)单克隆杂交瘤细胞株筛查及建立。ELISA法检测培养细胞上清,挑选阳性克隆,经阳性克隆筛选及连续三次亚克隆后,最终获得能稳定分泌抗NCXα-2(840-877)单克隆抗体的2株杂交瘤细胞,并将其分别命名为#2D2,#3F10。2.抗NCXα-2(840-877)单克隆抗体效价及纯度检测。纯化所得的两株抗体根据两株杂交瘤细胞的克隆号命名为抗NCXα-2(840-877)-2D2(以下简称2D2),抗NCXα-2(840-877)-3F10(以下简称3F10)。(1)纯化后的2D2抗体效价为1:81920,亲和常数9.33E+08;SDS-PAGE检测结果显示,2D2抗体在聚丙酰胺凝胶电泳时仅出现清晰的两条带,与Ig G标准品一致,纯化后的2D2抗体浓度为3.21 mg·ml-1。(2)纯化后的3F10抗体效价为1:40960,亲和常数3.8E+09。SDS-PAGE检测结果显示,3F10抗体在电泳时也仅出现清晰的两条带,与Ig G标准品一致,纯化后的3F10抗体浓度为1.62 mg·ml-1。3.抗NCXα-2(840-877)-3F10单克隆抗体对大鼠单个心室肌细胞INa/Ca的影响。INa/Ca测定在电压钳模式下进行。在本组之前的研究中已证实,2D2抗体对INa/Ca具有特异性抑制作用。本研究结果显示,50μg·ml-1的3F10抗体对INa/Ca呈剂量依赖性的抑制作用(P0.05),在钳制电位为+50 m V,-100 m V时,其抑制外向内向钠-钙交换电流的IC50分别为11.15和11.69μg·ml-1,最大抑制率分别达到61%,62%。4.抗NCXα-2(840-877)-3F10单克隆抗体对大鼠单个心室肌细胞ICa-L的影响。结果显示,在50μg·ml-1浓度范围内,3F10抗体能使钙电流密度减小,表现出抑制作用(P0.05)。5.抗NCXα-2(840-877)-3F10单克隆抗体对大鼠单个心室肌细胞IK1、Ito、INa的影响。在50μg·ml-1浓度范围内,3F10抗体对成年大鼠单个心室肌细胞内向整流钾电流(IK1),瞬时外向钾电流(Ito),钠电流(INa)均没有明显作用。6.抗NCXα-2(840-877)单克隆抗体对大鼠缺血/再灌注诱发心律失常的抑制作用。(1)10μg·ml-1的2D2、3F10抗体可明显抑制大鼠离体心脏缺血性心律失常的发生,在I/R组,100%大鼠发生室速,77.78%大鼠出现室颤,在缺血前5 min给予2D2、3F10抗体干预后,大鼠的室速发生率分别下降至22.2%和25%,室速、室颤的持续时间也有明显的缩短(P0.05)。(2)10μg·ml-1的2D2、3F10抗体可明显抑制大鼠离体心脏再灌注性心律失常的发生,在I/R组再灌注期间,100%大鼠发生室速,88.89%大鼠出现室颤,在再灌注前5min给予2D2、3F10抗体干预后,大鼠的室速发生率分别下降至20.09%和44.43%,室速、室颤的持续时间也有明显的减少(P0.05)。(3)在缺血前3 min给予50μg·kg-1 2D2、3F10抗体预处理后,可明显减少大鼠在体缺血性心律失常的发生。与缺血模型组相比,室速和室颤的发生率、持续时间以及室早的数目均明显减少(P0.05),其中2D2抗体抗心律失常的效应与利多卡因更为相似。(4)在再灌注前3 min给予50μg·kg-1 2D2、3F10抗体预处理后,可明显降低在体大鼠再灌注期室早的个数、室速的发生率及持续时间,室颤的发生率及持续时间(P0.05)。其中2D2抗体对再灌注性心律失常的作用与阳性对照组利多卡因效果相似。7.抗NCXα-2(840-877)单克隆抗体对大鼠单个心室肌细胞钙瞬变的影响。在50μg·ml-1浓度范围内,2D2、3F10抗体均能显著抑制正常大鼠单个心室肌细胞钙瞬变幅度,并呈剂量依赖性抑制(P0.05)。结论:1.利用人工合成的NCXα-2(840-877)肽段作为抗原,成功制备并纯化获得两株高效价NCX单克隆抗体2D2、3F10。2.在50μg·ml-1浓度范围内,2D2抗体对钠-钙交换电流表现出特异性的抑制作用。3F10抗体对大鼠心肌细胞钠-钙交换电流和L-型钙电流均表现为抑制效应,对内向整流钾电流、钠电流、瞬时外向钾电流均无明显作用。3.NCX 2D2、3F10两株抗体对大鼠离体和在体心脏缺血/再灌注诱发的心律失常均有明显抑制作用,其抗心律失常效应主要与抑制钠-钙交换、减轻细胞内钙超载有关。