Humanin拮抗冈田酸通过诱导Tau蛋白过度磷酸化所致神经毒的作用研究

作     者：赵晋枫 

作者单位：山西医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张策

授予年度：2007年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100203[医学-老年医学] 10[医学] 

主      题：阿尔采末病 tau蛋白 异常过度磷酸化 冈田酸(Okadaic acid,OA) Hunanin(HN) LDH MTT Calcein-AM染色 Caspase-3 TUNEL 

摘      要：阿尔采末病(AD)是最常见的以进行性记忆减退、认知障碍为特征的神经退行性疾病,其病理改变的主要特征是在大脑皮层和海马区域出现大量的老年斑(SP)、神经元纤维缠结(NTF)以及神经元的大量丢失。SP是由β—淀粉样蛋白(Aβ)在细胞外沉积而成,周围伴有营养不良的神经突、小胶质细胞和星形胶质细胞。NFT的主要成分是双螺旋纤维细丝(PHF),它是由tau蛋白过度磷酸化后形成。tau蛋白是一种微管相关蛋白主要存在于轴突内,由17号染色体(FTDP—17)的单基因编码。tau蛋白的主要功能是促进微管的形成和保持微管的稳定性。研究表明,tau蛋白磷酸化程度是体内多种蛋白激酶的磷酸化和蛋白磷酸酶的脱磷酸化两种作用平衡的结果。实验证实有四种蛋白磷酸酶(PPs),包括PP1,PP2A,PP2B和PP2C,在体外均可以使tau去磷酸化。其中,PP2A是脑内调节tau蛋白去磷酸化主要的磷酸酶。冈田酸(Okadaic acid,OA)是一种海洋生物提取物,对PP2A有抑制作用。体外研究表明,OA能使神经元微管相关蛋白tau异常过度磷酸化,过度磷酸化产生神经毒性,包括产生AD样的病理过程。 对AD病人的尸检发现,AD患者大脑皮层的枕叶在发病过程很少受累,这一现象引起了日本学者Hashimoto教授及其同事的浓厚兴趣,通过对这一脑区建立的cDNA文库的分析,最终于2001年发现了一种由24个氨基酸组成的线性多肽并将其命名为Humanin(HN)。研究发现,HN可以抑制APP、PS1、PS2突变诱发的神经元死亡,拮抗Aβ完整肽链及Aβ片断诱导的神经毒作用,而对其他原因的毒性似乎不表现保护作用。因此,发现者将其定义为AD特异性或AD相关毒性(AD related insults)的神经保护肽。但随着研究的深入,发现HN可通过降低Ca超载而维持胞内Ca稳态;通过提高ATP改善细胞功能;通过抑制Bax由胞浆转位至线粒体,抑制线粒体途径的凋亡;通过抑制JNK-c-jun及FasL的表达,抑制死亡受体途径的凋亡。本研究室的研究结果也发现,HN可以拮抗NMDA所致的兴奋毒、还可以拮抗缺氧所致的皮层神经元损伤。上述结果提示,HN很可能是一种具有广泛保护作用的神经保护因子。本研究拟观察HN拮抗OA通过诱导tau蛋白过度磷酸化所致的神经毒是否具有保护作用。 实验包括两个部分,第一部分为HN拮抗OA诱导皮层神经元毒性作用的观察(LDH、MTT检测和Calcein—AM染色)。第二部分为HN拮抗OA诱导皮层神经元凋亡的作用观察。 第一部分Humanin拮抗冈田酸诱导皮层神经元毒性作用的观察 本部分实验首先观察OA引起的大鼠皮层神经元的毒性作用,在此基础上观察HN对OA所致毒性作用的影响。OA的毒性作用通过两方面的指标观察,一是测定与细胞损伤相关的物质变化如乳酸脱氢酶(LDH)的含量,通常情况下细胞内的LDH很少释放,而当细胞受损后会引起LDH的大量释放,因此LDH测定可反映神经细胞损伤程度。另一指标体系是细胞活力的检测,包括MTT细胞活力分析及Calcein-AM染色反映活细胞数量,它们都可用来反映细胞活力从而确定细胞在OA毒性作用下细胞活力的降低及确定HN的神经保护作用。 实验结果: 一、LDH检测: ***引起上清液中的LDH升高: 分别加入不同浓度的OA(5、10、20hM)作用于培养细胞,随着OA浓度的增加,其毒性作用也逐渐显现,且呈现剂量依赖性。在倒置显微镜下即可直接观察到培养神经元受OA作用后形态的改变,如胞体折光性下降,突起回缩明显,甚至断裂溶解成碎片。上清液中LDH检测结果显示,5nM OA与对照组无明显差别,但10nM OA即可引起LDH的明显升高157.754±9.010(P0.05),20hM OA的损伤作用最强183.714±6.065(P0.05)。 ***拮抗OA引起的LDH升高发挥保护作用: 预先应用5μM的HN未能抑制OA引起的LDH升高,而10μM HN可降低OA引起的LDH升高141.862±6.901(P0.05),20μM HN可显著降低OA引起的LDH升高,由157.754±9.010降至126.352±6.511(P0.01)。 二、细胞活力检测: ***活性分析: (1)OA引起MTT水平降低: 检测结果与LDH基本相同,加入OA后,细胞活力显著降低,10nM、20nM的OA引起细胞活力从100%下降为72.71±6.82%(P0.05)和53.22±4.48%(P0.05),表现为MTT水平降低。随着浓度的增加,表现作用逐渐增强,20nM的OA毒性作用最强。 (2)HN拮抗OA引起的MTT降低发挥神经保护作用: 预先应用5州HN未能抑制OA引起的MTT降低,但101μM HN即可发挥拮抗作用,使细胞存活率由损伤后