α-突触核蛋白在木犀草素拮抗砷诱发PC12细胞凋亡中的作用机理

作     者：伍奕 

作者单位：重庆医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邱景富

授予年度：2017年

学科分类：100405[医学-卫生毒理学] 1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：砷 木犀草素 细胞凋亡 α-突触核蛋白 帕金森病 

摘      要：目的:分别利用砷、木犀草素单独及其联合处理体外培养的多巴胺能神经元PC12细胞,测定不同处理条件下细胞凋亡形态及水平、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)含量、凋亡标志物Caspase3活性、DNA损伤指标γ-H2AX和α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)表达的变化情况,探讨在木犀草素对砷诱发细胞凋亡的保护作用及其潜在机制,并揭示α-Syn在木犀草素拮抗砷诱发凋亡中作用机理。方法:首先采用不同浓度砷和木犀草素单独处理PC12细胞,运用MTT法检测细胞活性,筛选适宜处理剂量用于后续实验;其次,利用Hoechst33258染色观察凋亡细胞形态,吖啶橙/溴化乙啶(Acridine Orange/Ethidium Bromide,AO/EB)染色观察凋亡细胞百分数,流式细胞术定量检测细胞凋亡水平;同时,检测细胞内ROS水平,Caspase3活性以及γ-H2AX和α-Syn的蛋白表达水平,并运用siRNA技术靶向下调α-Syn的表达,深入探讨α-Syn表达对木犀草素拮抗砷诱发PC12细胞凋亡作用的影响。结果:利用不同浓度的砷(0.1,0.25,0.5,1,2.5,5,10,20和40μM)处理PC12细胞24 h,结果发现≥1μM砷处理可导致细胞活性显著下降,其中2.5μM砷染毒后细胞存活率为(71.12+7.15)%;而不同剂量(5,10,20μM)木犀草素单独处理对细胞活性无显著影响;2.5μM砷与不同剂量木犀草素联合处理均显示明显的保护效应,故选取2.5μM砷和20μM木犀草素联合处理用于后续实验。结果显示,砷与木犀草素联合作用组的细胞活性明显高于单独砷处理组、细胞凋亡水平明显低于单独砷处理组,差异有统计学意义(P0.05);而且,联合作用组细胞的ROS含量、Caspase 3活性、γ-H2AX及α-Syn蛋白表达水平均明显低于单独砷处理组,差异有统计学意义(P0.05);利用siRNA技术靶向下调α-Syn表达后,结果发现,木犀草素拮抗砷诱发的凋亡的保护效应明显增强,表现为细胞活性、ROS含量和凋亡水平的改善程度显著优于α-Syn表达未干预的联合作用组。结论:木犀草素可通过减少α-Syn积聚,降低ROS水平和Caspase3活性,减轻DNA损伤,进而拮抗砷诱发的细胞凋亡。该结果提示木犀草素可作为一种有效的抗氧化剂用于防治砷所致的包括帕金森病在内的神经功能损伤。