棉子糖对软骨细胞的保护作用及相关机制

作     者：王振 

作者单位：南京医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：范卫民

授予年度：2018年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：棉子糖 软骨细胞 过氧化氢 自噬 衰老 凋亡 

摘      要：目的探讨棉子糖(raffinose,RFN)对过氧化氢(hydrogen peroxide,HO)诱导的软骨细胞损伤的保护作用及相关机制。方法1.体外分离培养一周龄SD大鼠软骨细胞。CCK-8法检测棉子糖对HO作用下软骨细胞活力的影响。采用Western blot检测棉子糖对HO作用下软骨细胞P16INK4a、Cleaved Caspase-3蛋白表达的影响。2.将细胞随机分为5组,予100 mM棉子糖分别刺激不同时间(0,6,12,24,48 h)。用Western blot检测AMPK磷酸化水平及自噬相关蛋白Atg12-5、LC3、P62的表达。用免疫荧光技术评估100 mM棉子糖处理24 h对胞浆内LC3荧光斑点数量的影响。将细胞随机分为如下4组:(1)对照组:常规培养细胞;(2)造模组,400μM HO处理细胞24 h;(3)棉子糖预保护组,100 mM棉子糖预处理2 h后予HO刺激细胞24 h;(4)3-MA抑制自噬组,10 mM 3-MA预处理1 h后再予棉子糖及HO处理细胞24 h。用Western blot检测Atg12-5、LC3、P62的表达。用SA-β-Gal染色检测软骨细胞衰老率。用Annexin V-FITC/PI双标法评估细胞凋亡率。用Western blot检测各组p-P53、P53、P21及P16INK4a等衰老相关蛋白及Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3等凋亡相关蛋白的表达。3.将细胞随机分为如下4组:(1)对照组:常规培养细胞;(2)造模组,400μM HO处理细胞24 h;(3)棉子糖预保护组,100 mM棉子糖预处理2 h后予HO刺激细胞24 h;(4)Compound C抑制AMPK组,用10μM Compound C预处理细胞1 h后,再予棉子糖及HO处理细胞24 h。Western blot检测AMPK磷酸化水平及自噬相关蛋白Atg12-5、LC3、P62的表达。结果1.棉子糖预处理可缓解400μM HO对细胞活力的抑制作用,且其最适保护浓度为100 mM。Western blot结果证实,棉子糖预处理剂量依赖性抑制HO诱导的P16INK4a及Cleaved Caspase-3的表达。2.100 mM棉子糖时间依赖性的诱导AMPK磷酸化,上调Atg12-5的表达及LC3-II/I的比值,并下调自噬底物蛋白P62的水平。免疫荧光结果显示100mM棉子糖处理24 h显著增加胞浆内LC3荧光斑点的数量。棉子糖还显著上调HO作用下软骨细胞Atg12-5的表达、LC3-II/I的比值并下调P62水平。而棉子糖对Atg12-5、LC3及P62的调节作用均被自噬抑制剂3-MA逆转。与造模组相比,棉子糖预处理显著降低细胞衰老率和凋亡率。而棉子糖对衰老率、凋亡率的抑制作用被3-MA显著缓解。一致地,棉子糖对P53磷酸化、P21、P16INK4a蛋白表达等衰老标志物及Bax/Bcl-2比值、Cleaved Caspase-3表达等凋亡标志物的抑制作用也均被3-MA逆转。3.棉子糖上调HO作用下软骨细胞AMPK磷酸化水平。而棉子糖对AMPK磷酸化的促进作用被Compound C显著抑制。此外,棉子糖对自噬相关蛋白Atg12-5、LC3、P62的调节作用,也均被AMPK抑制剂Compound C显著抑制。结论1.棉子糖通过抑制HO诱导的细胞衰老及凋亡,从而发挥软骨保护作用。2.棉子糖通过诱导AMPK磷酸化促进软骨细胞自噬,从而抑制HO诱导的软骨细胞衰老和凋亡。