结合BMPs信号通路探讨固本增骨胶囊含药血清对大鼠BMSCs增殖和成骨分化的影响

作     者：蒋林博 

作者单位：甘肃中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：宋敏

授予年度：2018年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：骨质疏松症 固本增骨胶囊 骨髓间充质干细胞 成骨分化 BMPs信号通路 

摘      要：1目的1.1观察不同浓度固本增骨胶囊含药血清对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的效应,细胞内分布和细胞生物学行为;检测固本增骨胶囊含药血清成骨相关蛋白的表达,及BMPs信号通路相关基因的表达;探讨固本增骨胶囊治疗OP的机制。1.2为固本增骨胶囊的临床应用提供实验依据。2方法2.1培养大鼠BMSCs并传代,制备不同浓度的固本增骨胶囊含药血清(5%、10%、20%、30%),设置对照组,给药后以MTT法测大鼠BMSCs增殖率;采用碱性磷酸酶染色观察BMSCs的成骨分化情况;2.2采用ELISA技术检测成骨相关蛋白:一型胶原蛋白、碱性磷酸酶、骨钙蛋白、骨桥蛋白的浓度。探讨固本增骨胶囊含药血清对大鼠BMSCs成骨分化的影响。2.3采用Real-time PCR技术检测成骨相关的BMPs信号通路中BMP2、BMP4、Smad1、RUNX2的基因表达水平,探讨BMPs信号的激活情况,探讨固本增骨胶囊含药血清影响成骨分化的作用机制。3结果3.1 Wistar大鼠BMSCs的传代培养成功。3.2 MTT法测量细胞增值率:不同时点组间MTT比较差异均具有统计学意义(P0.05),其余组间均具有统计学意义(P0.05),提示20%含药血清组效果最佳。详细结果见表1、图2。3.3碱性磷酸酶染色观察:碱性磷酸酶染色后可见不同固本增骨胶囊含药血清组及传统诱导组细胞呈现蓝紫色细胞聚集区。含药血清组(5%、10%、20%)随着浓度增加,蓝紫色区域逐渐密集,当浓度达到20%时,染色区域最为密集,显著高于空白组与传统成骨诱导组,当浓度增加到30%时,染色区域减少。提示随着药物浓度的增加,BMSCs成骨分化程度升高,20%浓度时成骨分化效果最佳。详细结果见图33.4成骨相关蛋白检测:5%、10%、20%含药血清组骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原蛋白与其他各组比较差异均具有统计学意义(P0.05),且5%、10%、20%含药血清组蛋白浓度均高于其他组,而30%含药血清组、空白组、传统诱导组蛋白浓度无明显差异。其中以20%含药血清组蛋白浓度最高,提示20%含药血清组效果最佳,详细结果见表2-5、图4-7。3.5 BMP信号通路相关基因检测:Real-time PCR结果显示,10%、20%、30%含药血清组BMP2、BMP4、Smad1、RUNX2基因表达水平与其他各组比较差异均具有统计学意义(P0.05),且10%、20%、30%含药血清组BMP2、BMP4、Smad1、RUNX2均高于其余各组,而30%含药血清组、空白组、传统诱导组相关基因表达水平无明显差异。其中20%含药血清组基因表达水平为最高,提示20%含药血清组效果最佳,详细结果见表6-9、图8-11。4结论4.1固本增骨胶囊含药血清能明显促进大鼠BMSCs的成骨分化能力;4.2固本增骨胶囊含药血清能提高骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原蛋白的浓度;4.3固本增骨胶囊含药血清能明显上调BMP信号通路BMP2、BMP4、Smad1、RUNX2的mRNA的表达,促进骨形成。