锌指蛋白439在肝细胞性肝癌生长及转移中作用的初步研究

作     者：陈明明 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：林辉

授予年度：2017年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：肝细胞肝癌 锌指蛋白439 增殖 转移 细胞骨架 

摘      要：目的本课题旨在探究锌指蛋白439(zinc finger protein 439,ZNF439)在肝细胞性肝癌及其癌旁组织中的表达情况,初步探究其在肝细胞性肝癌发生发展过程中的作用。在人肝细胞性肝癌细胞株中过表达ZNF439,通过相关实验探究ZNF439对肝细胞性肝癌生长增殖及迁徙转移能力的影响。方法运用免疫组织化学方法,检测21例临床病理确诊的肝细胞性肝癌及其癌旁相对正常肝组织芯片标本,观察ZNF439在肝细胞性肝癌及其癌旁相对正常肝组织中的表达情况,同时比较ZNF439在二者中的表达差异。应用G418抗性筛选,在人肝癌细胞株Hep-3b及LM3中构建ZNF439过表达稳转细胞株。通过MTS法细胞生长增殖实验,检测ZNF439过表达对肝细胞性肝癌细胞生长增殖的影响;通过transwell小室细胞迁徙实验、细胞骨架荧光染色实验以及体外血管生成实验,检测ZNF439过表达对肝细胞性肝癌细胞迁徙转移能力的影响。结果在免疫组化实验中,ZNF439只在肝细胞核中表达,细胞浆中不表达。肝细胞性肝癌组织细胞核中,ZNF439主要呈阴性及弱阳性表达,分别占总病例数的66.7%和28.6%,其次为中等阳性表达,占总病例数的4.7%;而在癌旁肝脏组织细胞核中,ZNF439绝大多数呈现强阳性及中等阳性表达,分别占总病例数的38.1%和28.6%,其次为弱阳性表达,占总病例数的33.3%。通过卡方检验,两组之间质检存在显著性差异(P0.0001)。应用G418抗性筛选,成功在人肝细胞肝癌细胞株Hep-3b及LM3中构建了 ZNF439过表达稳转细胞株。并通过半定量RT-PCR和蛋白印迹免疫(Western Blot)方法进行了验证。MTS法细胞生长增殖实验表明,ZNF439过表达不影响Hep-3b及LM3人肝癌细胞株的生长增殖能力。通过transwell小室细胞迁移实验表明,ZNF439过表达后肝癌细胞Hep-3b及LM3的迁徙转移能力受到明显抑制。细胞骨架荧光染色实验显示,ZNF439基因过表达后Hep-3b及LM3细胞的环形骨架增多,极性减少,形态改变被抑制。体外血管生成实验表明,在LM3细胞中,ZNF439基因过表达后其微血管生成能力受抑制。然而在ZNF439过表达和空载的Hep-3b细胞株中,均未观察到微血管形态生成现象。结论ZNF439在肝细胞性肝癌组织及其癌旁肝脏组织中存在差异表达,提示ZNF439可能参与到肝细胞性肝癌的发生过程中。ZNF439不影响肝细胞性肝癌的生长增殖,但ZNF439可能通过抑制肝癌细胞自身形态改变和微血管生成,降低肝癌细胞的迁徙转移能力。