RSK4与TRAF4在不同乳腺细胞系中的表达及分子作用通路初探

作     者：杨宁 

作者单位：广西医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨华伟

授予年度：2017年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：人乳腺细胞株 RSK4 相互作用蛋白 TRAF4 慢病毒转染 ERK信号通路 

摘      要：研究背景:2015年中国肿瘤登记年报数据显示,对国人威胁最大的前6种癌症中,乳腺癌位居第四位。近年来乳腺癌发病率的增速已位居世界前列,每年约有20余万的新发病例,已经成为威胁我国女性健康的头号恶性肿瘤。研究显示,X染色体连锁基因P90核糖体S6蛋白激酶4(p90 ribosomal protein S6 kinase4,RSK4)在乳腺癌等多种癌症中具有抑制癌细胞的增殖、侵袭、转移并诱导细胞衰老的作用。众所周知,乳腺癌是多基因共同作用的全身性疾病,承担生命活动功能的蛋白质也离不开与其他蛋白质的相互作用关系。本课题组前期通过质谱分析等研究找到感兴趣相互作用蛋白肿瘤坏死因子受体相关因子4(tumor necrosis factor receptor associated factor 4,TRAF4)。本课题通过检测四种不同乳腺细胞株中RSK4、TRAF4的表达,利用慢病毒载体将稳定过表达RSK4的载体转染至乳腺癌MDA-MB-231细胞株中,之后检测MDA-MB-231细胞株中TRAF4表达量的变化,研究RSK4、TRAF4两者的相关性,从而为研究乳腺癌的发生发展以及治疗开辟新的思路。研究目的:本课题前期研究发现RSK4与TRAF4存在相互作用,本研究检测RSK4-TRAF4在四种不同乳腺细胞株以及稳定过表达RSK4的乳腺癌MDA-MB-231细胞株中的表达量,并做相关性分析,初步探索RSK4-TRAF4对乳腺癌发生发展的调控作用。研究方法:采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法从mRNA水平检测RSK4和TRAF4在人乳腺细胞株HBL-100、乳腺癌细胞株MCF-7、HER2阳性型、MDA-MB-231中的表达情况。利用蛋白质印迹法(Western-blot)从蛋白水平检测RSK4和TRAF4以及MAPKs通路的下游蛋白ERK1/2在人乳腺细胞株HBL-100、乳腺癌细胞株MCF-7、HER2阳性型、MDA-MB-231中的表达情况,结合RT-PCR实验结果,分析RSK4和TRAF4之间的关系。将稳定过表达RSK4的载体(LV-RPS6KA6)以及阴性对照载体(LVCON145)分别转染至乳腺癌MDA-MB-231细胞株中,设立实验组细胞、阴性对照组细胞、和未转染的MDA-MB-231空白对照组细胞;实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测RSK4和TRAF4mRNA表达量。蛋白质印迹法(Western-blot)检测RSK4蛋白、TRAF蛋白以及MAPKs通路的下游ERK1/2蛋白含量,进一步对RSK4——TRAF4进行相关性分析。实验结果:***4、TRAF4 mRNA在四种细胞中均有表达,RSK4 mRNA在HBL-100表达量最高,在MCF-7、HER2阳性型、MDA-MB-231细胞中含量依次降低;TRAF4 m RNA在四种细胞中的表达量由低到高依次为HBL-100、MCF-7、HER2阳性型、MDA-MB-231细胞,RSK4、TRAF4 m RNA分别在四个细胞组间两两比较,差异均有统计学意义(P0.05)。***4蛋白产物在HBL-100乳腺细胞中表达量最高(0.789±0.010)、MCF-7细胞次之(0.683±0.013)、HER2阳性型较低(0.602±0.015)、MDA-MB-231细胞最低(0.526±0.006);TRAF4蛋白含量在四种细胞中由高到低依次为MDA-MB-231细胞(0.890±0.058)、HER2阳性型(0.817±0.059)、MCF-7细胞(0.744±0.057)、HBL-100细胞(0.682±0.036);ERK1/2蛋白表达量由高到低依次为MDA-MB-231细胞(0.824±0.032)、HER2阳性型(0.713±0.024)、MCF-7细胞(0.358±0.021)、HBL-100细胞(0.290±0.018)。***4与TRAF4在四种细胞中蛋白表达水平与mRNA表达水平相一致,具有高度相关性,相关系数分别为r=0.92,P0.01;r=0.82,P0.01;在mRNA转录水平,RSK4和TRAF4之间表现出负相关性,r=-0.81,P0.01;在蛋白翻译水平,RSK4和TRAF4之间同样呈现出高度负性相关关系,r=-0.84,P0.01。4.构建RSK4慢病毒过表达载体稳定转染至细胞后,实验组、阴性对照组、空白对照组RSK4 mRNA的相对表达量(2)用均数±标准差来表示分别为1±0、0.2590±0.02132、0.3204±0.08168。RSK4 mRNA在阴性对照组和空白对照组含量低,与实验组含量相比,差异有统计学意义(F=427.2,P0.0001),两两比较,实验组细胞RSK4 mRNA的相对表达量明显高于空白组(