前列腺干细胞抗原（PSCA）对前列腺癌细胞周期的调控及其机制研究

作     者：黎富添 

作者单位：广州医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：赵志刚

授予年度：2017年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：前列腺癌 前列腺干细胞抗原 增殖 周期 凋亡 c-myc 

摘      要：【研究背景】前列腺干细胞抗原(prostate stem cell antigen,PSCA)基因编码一个由123个氨基酸组成的糖蛋白,与SCA-2一样,均属于细胞表面葡萄糖磷酯酰肌醇(glycosyl phosphatidylinositol,GPI)锚定抗原(Thy-1/Ly-6基因)家族成员。目前相关研究表明PSCA具有很高的前列腺癌组织特异性,并且在局部进展性前列腺癌组织以及前列腺癌骨转移灶中高表达,提示PSCA可能在前列腺癌进展中起重要作用。然而,其具体生物学机制仍不清楚。【目的】研究PSCA在前列腺癌细胞增殖中的作用,并初步探讨其对周期凋亡的调控机制。【材料和方法】前期已成功构建的稳定沉默PSCA的DU145细胞株及稳定过表达PSCA的LNCAP细胞株。30只小鼠随机分为6组,每组5只:DU145,DU145-NC(稳定转染无关序列的DU145细胞),DU145 shRNA(稳定沉默PSCA的DU145细胞)、LNCAP,LNCAP-vector(稳定转染空载体的的LNCAP细胞),LNCAP PSCA(稳定过表达PSCA的LNCAP细胞)。通过MTS、平板克隆形成实验等体外功能实验以及动物移植瘤实验研究PSCA对前列腺癌细胞增殖的影响;通过流式细胞术了解细胞周期凋亡的变化,PCR、Weston blot等实验检测细胞周期凋亡相关基因表达;免疫组化染色研究组织PSCA以及c-myc等周期相关基因的表达;使用c-myc-siRNA对过表达PSCA的LNCAP进行转染,进一步研究PCSA对c-myc的调控作用;收集2013年12月前在我院前列腺癌初治病例。该研究纳入的所有病例均行前列腺穿刺活检或手术后的病理检查确诊为前列腺腺癌,并且相关检查未见远处转移;纳入患者的病理组织收集前均未接受化学治疗或者放疗;病例资料中如缺失随访资料、术前PSA值、Gleason评分、手术切缘情况或淋巴结是否转移等描述均予以排除。通过病历查找、电话随访对患者年龄、血清PSA、Gleason评分、肿瘤临床分级、生化复发、总体生存等资料进行采集。【结果】MTS结果显示:与对照组相比,72小时后,DU145-shRNA细胞增殖能力明显较对照组减弱(P=0.000);而过表达PSCA的LNCAP细胞增殖能力在48小时后明显较对照组增强(P=0.000)。平板克隆实验:DU145细胞在平板实验中第7天便有较多的肉眼可见的克隆,于第七天终止实验,进行后续的染色;而LNCAP细胞则需到14天才出现较多的肉眼可见的克隆,于第14天终止实验,进行后续的染色。结果显示,在沉默PSCA的表达后,DU145 shRNA与对照组相比,形成的克隆更少、更小(P=0.000);同样的,过表达PSCA后的LNCAP与对照组相比,LNCAP PSCA的克隆数目明显增多(P=0.000)。动物体内移植瘤实验结果:与体外细胞功能实验结果相一致,PSCA明显加速了移植瘤在裸鼠体内的生长速度:DU145shRNA组在接种第19天后移植瘤体积开始明显小于对照组(P=0.000);过表达PSCA后,LNCAP-PSCA组在接种2周后体积明显比对照组增大;4周后对移植瘤进行解剖称重,肉眼所见,DU145 shRNA与LCAP-vector移植瘤大体观上较对照组小;DU145 shRNA瘤重明显较对照组减小,而LNCAP-PSCA瘤重明显较对照组增加(P=0.0000)。流式细胞术:,在正常DU145组G0/G1期细胞(48.56%±2.0%)明显增加至DU145shRNA组(60.32%±1.2%,P=0.000),DU145 NC组G0/G1期细胞为49.47%±2.5%,与正常组比较差异(P=0.492);DU145-shRNA组凋亡率4.87%±0.48%,DU145-NC组凋亡率4.70%±0.61%,DU145组凋亡率4.23%±0.53%,经比较差异无统计学意义(P=0.494);LNCAP-PSCA组凋亡率1.89%±0.37%,LNCAP-vector组凋亡率2.26%±0.13%,LNCAP正常组凋亡率2.56%±0.18%,经比较差异无统计学意义(P=0.124)。qRT-PCR以及weston blot结果显示:与DU145-NC组比较,DU145shRNA组无论在mRNA水平或者蛋白水平,c-myc、cyclin D1、cyclin E2表达下调P=0.000);与之相反,在过表PSCA的LNCAP组中c-myc、cyclin D1、cyclin E2表达上调(P=0.000)。与周期抑制相关的基因P16、P27、凋亡相关蛋白caspase 3并没有明显差异。免疫组织化学法染色显示,动物移植瘤组织DU145siRNA组组织表达PSCA、c-myc、cyclin D1