c-Ski基因对青光眼性视神经损伤保护作用及机制研究

作     者：张艳 

作者单位：西南医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：余玲

授予年度：2018年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100212[医学-眼科学] 10[医学] 

主      题：c-Ski N-甲基-D-天门冬氨酸 青光眼 视神经保护 TGF-β/Smad信号通路 细胞外基质 

摘      要：第一部分N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)诱导大鼠正常眼压青光眼模型的建立目的:探索N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)诱导大鼠正常眼压青光眼模型的最佳方案。方法:36只SD大鼠随机均分为4组,正常对照组(A组),实验组27只右眼玻璃体腔注射NMDA 5μl,依注射剂量20nmol,40nmol,80nmol随机等分为B组、C组、D组,左眼玻璃体内注射5μl PBS作为自身对照组(E组),分别于3d、7d、14d后处死大鼠摘除眼球。通过视网膜HE染色检测视网膜神经节细胞复合体(ganglion cell complex,GCC)厚度、TUNEL法检测视网膜神经节细胞层(ganglion cell layer,GCL)细胞凋亡率(apoptosis index,AI)。结果:1.视网膜HE染色发现经NMDA干预后的B、C、D组各时间点视网膜GCC厚度均比A组明显变薄(P0.05)。2.TUNEL检测发现经NMDA干预后的B、C、D组各时间大鼠视网膜GCL细胞AI明显高于A组(P0.05)。结论:使用NMDA建立正常眼压性青光眼大鼠模型的最佳剂量为40nmol,最佳取材时间为玻璃体腔注射NMDA后14天。第二部分c-Ski基因过表达和干扰重组II型腺相关病毒载体的构建目的:构建c-Ski基因过表达和干扰的重组II型腺相关病毒(Recombinant type II adeno-associated viruses,rAAV2)表达载体,达到能进行基因治疗的动物实验的有效滴度。方法:构建同时表达c-Ski和绿色荧光(GFP)基因的重组II型腺相关病毒载体(rAAV2-c-Ski/GFP),仅表达GFP基因的重组II型腺相关病毒载体(rAAV2-GFP)作为对照。Real-Time PCR法检测病毒滴度。同法构建干扰c-Ski基因表达的重组II型腺相关病毒载体(rAAV2-c-Ski-shRNA/GFP)。结果:成功构建c-Ski基因过表达的重组II型腺相关病毒表达载体,经酶切和测序鉴定,仅有一处碱基改变,即第1476位的C突变为T,但所编码的氨基酸不受影响,其他序列完全相同。经293T细胞包装获得病毒rAAV2-c-Ski/GFP和rAAV2-GFP,病毒滴度均为1.55×10 v.g./ml。同法获得病毒rAAV2-c-Ski-shRNA/GFP,滴度为2.03×10v.g./ml;rAAV2-NC-sh RNA/GFP,滴度为1.56×10 v.g./ml。结论:成功构建c-Ski基因过表达和干扰的重组II型腺相关病毒表达载体,包装产生重组腺相关病毒,在293T细胞内验证了病毒滴度的有效性。第三部分研究重组II型腺相关病毒介导c-Ski基因过表达及干扰对青光眼性视神经损伤的作用目的:观察重组II型腺相关病毒(Recombinant type II adeno-associated viruses,rAAV2)介导c-Ski基因在视网膜的转染情况,探讨c-Ski对青光眼性视神经损伤的保护作用及可能的机制。方法:共128只雄性SD大鼠,将60只SD大鼠随机分为五组,A组:正常组、B组:青光眼组、C组:青光眼+rAAV2-c-Ski/GFP组、D组:青光眼+rAAV2-GFP组、E组:正常+rAAV2-c-Ski/GFP组,每组12只。将另外60只SD大鼠也随机分为五组,a组:正常组、b组:青光眼组、c组:青光眼+rAAV2-c-Ski-shRNA/GFP组、d组:青光眼+rAAV2-NC-shRNA/GFP组、e组:正常+rAAV2-c-Ski-shRNA/GFP组,每组12只。再取8只SD大鼠随意分成两组,G组为玻璃体腔注射rAAV2-GFP组,S组为玻璃体腔注射rAAV2-c-Ski/GFP组。C、E、S组每只大鼠的右眼玻璃体腔注射5μl滴度为1.55×10 v.g./ml的rAAV2-c-Ski/GFP,c、e组每只大鼠的右眼玻璃体腔注射5μl滴度为2.03×10 v.g./ml的rAAV2-c-Ski-shRNA/GFP,D、G组每只大鼠的右眼玻璃体腔注射5μl滴度为1.55×10 v.g./ml的rAAV2-GFP,d组每只大鼠的右眼玻璃体腔注射5μl滴度为1.56×10 v.g./ml的rAAV2-NC-shRNA/GFP;两周后B(b)、C(c)、D(d)组每只大鼠的右眼玻璃体腔注射5μl,剂量为40nmol的NMDA;玻璃体腔注射NMDA两周后行闪光视觉诱发电位(Flash-visual evoked potential,F-VEP)和视网膜电图(electroretinogram,ERG)检查,然后处死大鼠,取右眼球制作视网膜冰冻切片、视网膜铺片、石蜡切片、提取视网膜蛋白。视网膜冰冻切片观察rAAV2-GFP、rAAV2-c-Ski/GFP在视网膜的转染情况、视网膜HE染色检测各组的视网膜神经节细胞复合体(ganglion cell complex,GCC)厚度、TUNEL法检测各组视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)凋亡数、western bolt印迹法检测视网膜c-Ski蛋白、B细胞淋巴瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、BCL-2相关X蛋白(BCL2-associated X protein,Bax)、转化生长因子-β2蛋白(transforming growth factor-β,TGF-β2)、Smad2蛋白、Smad 3蛋白、磷酸化Smad2(p-Smad2)、磷酸化Smad 3蛋白(p-Smad 3)、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)相关蛋白(纤维连接蛋白(Fiberonectin,FN))、层粘连蛋白(Laminin,LN))表达情况。结果:1.荧光显微镜观察视网膜冰冻切片发现,rAAV2能成功介导c-Ski基因在视网膜中表达,绿色荧光(GFP)阳性转染细胞主要位于视网膜GCL。2.ERG及F-VEP检查发现,B(b)、C(c)、D(d)组b波振幅值及N1-P1振幅值较A(a)、E(e)组明显降低(P0.05),C组经c-Ski基因干预后b波振幅值和N1-P1振幅值明显回升(P0.05),而c组经c-Ski-shRNA干预后b波振幅值及N1-P1振幅值进一步明显降低(P0.05)。3.HE染色发现,B(b)、C(c)、D(d)组视网膜GCC厚度较A(a)、E(e)组明显变薄(P0.05),C组经c-Ski基因干预后GCC厚度较B、D组增厚(P0.05),而c组经c-Ski-shRNA干预后GCC厚度较b、d组进一步变薄(P0.05)。4.TUNEL检测发现B(b)、C(c)、D(d)组视网膜组织中RGC层凋亡神经元密度(Apoptotic Neurons Counts,ANC)(个/mm)明显高于A(a)、E(e)组(P0.05),C组经c-Ski基因干预后视网膜RGC层ANC明显低于B、D组(P0.05),而c组经c-Ski-shRNA干预后视网膜RGC层ANC明显高于b、d组(P0.05)。5.Western Blot印迹检测发现C、E组视网膜c-Ski蛋白表达较A、B、D组显著增加(P0.05);而c、e组视网膜c-Ski蛋白表达较a、b、d组显著减少(P0.05);B(b)、C(c)、D(d)组与A(a)、E(e)组相比视网膜TGF-β2、p-Smad2、p-Smad3蛋白表达量明显增加(P0.05),C组经c-Ski干预后视网膜TGF-β2、p-Smad2、p-Smad3蛋白表达量较B、D组降低(P0.05),而c组经c-Ski-shRNA干预后视网膜TGF-β2、p-Smad2、p-Smad3蛋白表达量较b、d组进一步增加(P0.05),各组间视网膜Smad2、Smad3、Smad4蛋白表达量变化没有差异;B(b)、C(c)、D(d)组与A(a)、E(e)组相比视网膜Bax/Bcl-2明显增加(P0.05),C组经c-Ski干预后视网膜Bax/Bcl-2较B、D组降低(P0.05),而c组经c-Ski-shRNA干预后视网膜Bax/Bcl-2较b、d组进一步增加(P0.05);B(b)、C(c)、D(d)组与A(a)、E(e)组相比视网膜FN、LN蛋白表达量明显增加(P0.05),C组经c-Ski干预后视网膜FN、LN蛋白表达量较B、D组降低(P0.05),而c组经c-Ski-shRNA干预后视网膜FN、LN蛋白表达量与b、d组相比进一步增加(P0.05)。结论:1.rAAV2能成功介导c-Ski基因在视网膜中表达,阳性转染细胞主要位于视网膜GCL。2.rAAV2-c-Ski对正常眼压青光眼性视神经损伤具有一定保护作用,其可能机制是c-Ski通过抑制Smad2、Smad3磷酸化而抑制TGF-β/Smad信号通路,使视网膜ECM沉积减少,增加Bcl-2表达、降低Bax表达,从而减少RGC凋亡。