HMGB1抑制剂甘草次酸衍生物的合成、抗抑郁活性评价及分子对接研究

作     者：于宗民 

作者单位：中国人民解放军海军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张卫东

授予年度：2018年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100701[医学-药物化学] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：HMGB1 甘草次酸 结构修饰 衍生物 抗抑郁 分子对接 

摘      要：抑郁症是一种以情绪低落、兴趣丧失、厌恶活动、认知缺陷和注意力不集中为特征的精神障碍。在全球范围内,有三亿多不同年龄的人患有抑郁症,这使得抑郁症成为导致残疾的主要原因之一。虽然传统的抗抑郁药物治疗很普遍,但大约有三分之一的患者是治疗无效的,抑郁症发生发展的机制研究仍不是很清楚。近年来,大量的数据表明,免疫系统,尤其是炎症系统,在抑郁症的发病机制中起着重要的作用。2015年第二军医大学蒋春雷课题组首次报道了高迁移率族蛋白B1(High-mobility group box-1 protein,HMGB1)的抑郁诱导作用。HMGB1作为一种晚期炎性因子,在脂多糖(LPS)刺激后主动分泌,参与了LPS诱导的抑郁样行为,并且抑制HMGB1对抑郁障碍有疗效。HMGB1是一种高度保守的核蛋白,在细胞受到损伤或应激时释放或分泌。其因在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中快速迁移而得名。细胞外的HMGB1通过与多个受体结合而具有多种活性,其中RAGE、TLR2、TLR4是HMGB1结合的3个主要受体。HMGB1与RAGE结合活化NF-κB通路,诱导多种细胞因子产生,促进炎症反应。HMGB1与TLR2、TLR4结合激活MyD88依赖性NF-κB通路,促进TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症细胞因子表达和释放。HMGB1有三个主要的结构域:两个DNA结合基序Box A和Box B,以及一个酸性C末端。天然产物在药物发现中起着重要作用,在过去的二十多年里上市的近一半新药是天然产物或其衍生物。甘草酸是从甘草根中提取的三萜皂苷类化合物,具有广泛的药理特性。2007年Molica等首次报道了甘草酸通过与HMGB1的两个盒(Box A,Box B)直接结合(K约为150μM)来抑制HMGB1,从而抑制了其趋化活性和有丝分裂活性。研究目的:基于甘草酸与HMGB1的对接研究结果,及HMGB1与抑郁行为发生的研究进展,本课题选择与蛋白HMGB1相互作用的核心骨架甘草次酸(甘草酸的苷元部分)为先导结构进行优化修饰并考察衍生物的抗抑郁活性。在保留甘草次酸五环三萜母核结构,主要药效基团11位羰基及30位羧基的前提下,重点对甘草次酸A环展开结构修饰。借鉴已有报道中关于三萜酸A环与杂环稠合可提高抗炎活性的研究,我们尝试将不同杂环结构与甘草次酸A环稠合进而考察这些衍生物的抗抑郁活性。期望A环特定稠合杂环结构及侧链结构的引入能够增强目标化合物与HMGB1的相互作用,同时通过调节目标化合物的脂水分配系数,改善其透过血脑屏障的能力进而更利于其发挥抗抑郁活性,为寻找新型抗抑郁先导化合物提供新的证据。研究内容:1、甘草次酸衍生物的设计与合成。通过酯化、氧化、亲核取代、环合及水解反应在甘草次酸A环引入吡唑环、取代吡唑环、吲哚环、取代吲哚环及异噁唑环,得到16个甘草次酸衍生物。以甘草酸、甘草次酸及甘珀酸为阳性对照,在RAW264.7细胞上通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测目标化合物抑制炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β释放的能力,同时检测了目标化合物对NO释放能力的影响。结果表明,N-苯基取代吡唑稠合类衍生物在30μM和10μM浓度条件下表现出较好的抗炎活性。根据这一结果,进一步选择“N-苯基取代吡唑作为优选结构进行修饰,通过在苯基上引入不同性质的取代基,共合成得到了21个全新结构的N-苯基取代吡唑A环稠合甘草次酸衍生物。所有关键中间体及目标化合物结构均经核磁共振氢谱、碳谱及高分辨质谱确证。2、甘草次酸衍生物的体外活性研究。将合成得到的衍生物及阳性对照药共计39个化合物在RAW264.7细胞和BV2细胞上进行抗炎活性测试。采用流式细胞技术检测目标化合物抑制RAW264.7细胞释放炎性因子TNF-α、IL-6的能力。结果表明,在30μM和10μM浓度条件下,GA-21T、GA-25T、GA-51T等20个N-苯基取代吡唑稠合类衍生物表现出较强抗炎活性,其中衍生物GA-21T、GA-51T在10μM浓度以下仍能表现出一定的抗炎活性。进一步将抗炎活性较好的20个衍生物在BV2细胞上通过ELISA检测其抑制炎性因子TNF-α、IL-6释放的能力。结果表明,衍生物GA-25T在BV2细胞上表现出较好的抗炎活性,特别是在10μM浓度条件下,其抗炎效果和氟西汀相当。综合两种细胞的筛选结果,最终确定衍生物GA-21T、GA-25T、GA-51T为优选化合物(三个优选化合物与HMGB1的结合实验正在进行中)。3、优选化合物的体内抗抑郁活性评价。采用LPS造模后脑内直接给药以及rHMGB1造模后腹腔给药两种方式来评价优选化合物的体内抗抑郁活性。LPS造模后脑内直接给药的实验结果显示,衍生物GA-21T可以明显改善LPS诱导的抑郁样行为。rHMGB1造模后腹腔给药的实验结果显示,衍生物GA-21T可以