同型半胱氨酸诱导血管内皮氧化应激调节树突状细胞功能参与动脉粥样硬化的研究
作者单位：浙江大学
学位级别：硕士
导师姓名：朱建华
授予年度：2007年
主 题：同型半胱氨酸 内皮细胞 氧化应激 树突状细胞 过氧化物歧化酶 动脉粥样硬化
摘 要：同型半胱氨酸诱导血管内皮氧化应激调节树突状细胞功能参与动脉粥样硬化的研究 【目的】 近年来研究发现，动脉粥样硬化是一种自身免疫性炎症疾病，树突状细胞及其功能活性在其发生发展过程中起着重要的作用。大量临床和流行病学的研究已经证实体内同型半胱氨酸水平增高是导致动脉粥样硬化发生发展的一个重要的独立危险因素，但目前对于同型半胱氨酸诱导动脉粥样硬化形成的具体机制尚未完全明确。本研究通过观察同型半胱氨酸对血管内皮细胞产生氧自由基的影响，及同型半胱氨酸激活的内皮细胞对树突状细胞粘附和迁移功能的作用，探讨同型半胱氨酸致动脉粥样硬化的病理机制，并为临床防治高同型半胱氨酸血症诱发的动脉粥样硬化提供科学依据。 【方法】 (一)、人脐静脉内皮细胞分离及培养。 严格无菌条件下取健康产妇剖腹产分娩的新生儿脐带，采用胶原酶消化法分离获得人脐静脉内皮细胞，加入含有15％胎牛血清、10ng／mL rhEGF的M199培养液，置37℃，5％CO2孵箱培养。第2～4代内皮细胞用于本实验研究。 (二)、人外周血单核细胞的分离纯化，树突状细胞的培养。 取新鲜的健康成人志愿者外周血，以密度梯度离心法分离外周血单核细胞，以免疫磁珠法提纯获得CD14+细胞，加入rhIL-4和rhGM-CSF诱导分化成树突状细胞，常规培养5天后收集悬浮细胞，作为未成熟树突状细胞用于本实验研究。 (三)、实验分组与药物干预。 实验共分三大组：空白对照组(只加新鲜的M199培养液)，Hcy组(0.01 mmol／L，0.05 mmol／L，0.1 mmol／L，0.5 mmol／L和1.0 mmol／L)，Hcy0.5+SOD组(先用SOD200U／mL预处理1h，再加Hcy 0.5 mmol／L干预24h)，药物干预24h后进行下一步实验。 (四)、免疫荧光试验检测同型半胱氨酸对内皮细胞产生氧自由基的影响。 1、内皮细胞生长至融合，分组加药干预24h。 2、加入分子探针hydroethidine，于37℃孵育45min。 3、立即在倒置显微镜下观察，并运用MetaMorph软件测定目标区域的荧光强度。 4、每组随机选取6个独立的高倍镜视野，运用MetaMorph软件中的Meta Imaging Series程序计算平均荧光强度，代表内皮细胞产生氧自由基的相对量。 (五)、细胞粘附试验检测同型半胱氨酸激活的内皮细胞对树突状细胞粘附功能的影响。 1、收集树突状细胞，并用CMFDA分子探针作荧光标记。 2、将已标记的树突状细胞与各实验组内皮单细胞层于37℃共孵育。 3、共孵育1h后吸弃上清，轻柔洗去未粘附的树突状细胞，再加3.7％多聚甲醛固定20min。 4、立即在共聚焦显微镜下观察树突状细胞的粘附情况。 5、每组随机摄取6个不同高倍镜视野，计算每个视野中粘附的树突状细胞量与相应内皮细胞量的比值，得出各组树突状细胞粘附的平均值，以DC／EC粘附率表示，代表各组DC的粘附能力。 (六)、细胞迁移试验检测同型半胱氨酸激活的内皮细胞对树突状细胞迁移功能的影响。 1、内皮细胞培养于Transwell板的上层小室(预先用纤维连接蛋白包被)，生长至融合后分组加药干预24h。 2、将已标记CMFDA分子探针的树突状细胞加于上层小室的各组内皮单细胞层上，并在下层小室中加入含MCP-1的无血清培养基。 3、两种细胞于37℃共孵育8h，停止迁移试验。 4、立即用多功能全自动定量绘图酶标仪测定下层小室内细胞相对荧光强度代表迁移树突状细胞的相对数量。 5、计算每组迁移的树突状细胞数与其对应DC／EC粘附率的比值，以迁移指数表示，代表各组树突状细胞的迁移能力。 【结果】 1、Hcy对EC产生氧自由基的影响：与空白对照组相比，Hcy组中浓度为0.01mmol／L的Hcy亚组，，对EC未产生明显影响(P0.05);随Hcy浓度增加(0.05 mmol／L，0.1 mmol／L，0.5 mmol／L和1.0 mmol／L)，EC产生氧自由基亦随之增多，均有统计学意义。其中，Hcy0.05mmol／L组即显示较对照组EC产生氧自由基增多(P0.05)，而另3组(0.1 mmol／L，0.5 mmol／L和1.0 mmol／L)致EC产生氧自由基则更为显著(P0.01)。Hcy0.5+SOD组虽较空白对照组氧自由基产生无明显减少(P0.05)，但与Hcy 0.5mmol／L组相比氧自由基产生明显减少(P0.01)。 2、Hcy激活的EC对DC粘附功能的影响：Hcy组中浓度为0.01mmol／L组、0.05mmol／L组较对照组对DC粘附数量无明显增多，比较无统计学意义(P0.05);而Hcy浓度为0.1 mmol／L组和0.5 mmol／L组则显示DC粘附数量明显增多(P0.05)，Hcy1.0mmol／L组DC的粘附数量增加更为显著(P0.01)。Hcy0.5+SOD组虽较空白对照组DC的粘附数量无明显减少(P0.05)，但与Hcy 0.5 mmol／L组相比DC的粘附数量明显减少(P0.01)。 3、Hcy激活的EC对DC迁移功能的影响：随Hcy浓度增加，DC的迁移指数增加，但0.01mmol／L组、0.05 mmol／L组较对照组无统计学意义(P0.05);而Hcy浓度为0.1mmol／L组和0.5 mmol／L组则显示DC迁移明显增多(P0.05)，Hcy1.0 mmol／L组的DC迁移更为显著(P0.01)。Hcy0.5+SOD组虽较空白对照组DC的迁移无明显减少(P0.05)，但与Hcy 0.5 mmol／L组相比DC的迁移明显减少(P0.01)。 【结论】 1、Hcy能诱导人脐静脉EC氧化产生氧自由基，并通过Hcy诱导氧化的EC促进DC的粘附和迁移功能，且呈浓度依赖性。 2、氧自由基清除剂SOD可拮抗Hcy的致氧化作用，并能拮抗DC的粘附和迁移。
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