钠钾ATP酶配体精密调控Amphiregulin表达的分子机制与生物学意义
作者单位：南京大学
学位级别：硕士
导师姓名：殷武
授予年度：2015年
学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学]
摘 要：钠钾ATP酶(Na/K-ATPase)又名钠泵,是哺乳动物细胞膜上的一种跨膜蛋白,通过利用ATP水解释放的能量,逆浓度梯度及时将细胞内多余的钠离子泵出细胞外,而相应地将细胞外钾离子泵入细胞内,从而维持细胞膜内外的电化学梯度,促进其它离子、氨基酸、葡萄糖或其它营养物质进入细胞。钠钾ATP酶是强心苷类物质(cardiotonic steroids,CTS)的特异性作用受体,通过竞争胞外K+的结合位点,CTS能抑制钠钾ATP酶的离子转运活性。CTS最初是从植物体中分离得到的,但越来越多的研究发现,哺乳动物,包括人体中也存在内源性的强心苷类物质,如哇巴因(ouabain)。这类活性物质具有促进心肌和动脉血管收缩的功能,是临床用以治疗心衰和房性心律失常的重要药物。但长期以来,内源性CTS的功能处于未知状态。随着对CTS类物质研究的不断深入,人们发现CTS能够激活多种生长信号通路,在特定的细胞中参与细胞的增殖、分化、凋亡等,如ouabain可以调节细胞的增殖、凋亡、粘附以及迁移。值得关注的是,CTS在低浓度状态下具有调节细胞生长的功能,但这样的浓度不足以抑制钠泵转运离子的功能。因此,钠钾ATP酶具有双重功能,一是作为离子转运载体,二是不依赖于离子转运活性,作为CTS受体介导信号传递功能。双调蛋白(Amphiregulin,AREG)是一种EGFR配体,通过与EGFR结合并激活下游的信号通路,从而调控细胞的增殖、迁移以及凋亡。在肿瘤细胞中,AREG往往大量表达;在发生炎症、损伤的多种组织中AREG的表达水平均较高,且AREG参与细胞的防御和修复,发挥保护细胞的作用。本研究发现强心苷类物质ouabain能选择性激活上皮细胞(人肺上皮A549、宫颈上皮hela细胞、人肾近曲小管上皮细胞HK-2)中AREG的表达,且这种激活效应具有时间和浓度依赖性。研究表明,在多发性肾囊肿病人或肾损伤病人体内ouabain的表达增高,可能与肾细胞生长相关,但作用机制并未完全阐明。本实验发现低浓度的ouabain能够促进HK-2细胞的生长,干扰AREG表达之后,ouabain的促生长作用被显著抑制。进一步研究表明,ouabain诱导产生的AREG也能以旁分泌方式刺激其它HK-2细胞的生长。草酸是机体代谢产物,主要以草酸钙的形式存在,在肾小管上皮细胞上沉积,对肾小管的功能产生极大的损害作用。实验发现1mM浓度草酸钙显著抑制HK-2细胞的生长,而ouabain可以通过上调AREG缓解草酸钙的损伤作用。因此,AREG在ouabain对上皮细胞,尤其是肾小管上皮细胞的保护作用中发挥重要作用。本实验探讨了 ouabain激活AREG的作用机制。研究发现ouabain能够在转录水平激活AREG的表达。通过构建AREG启动子报告基因,发现AREG启动子区的CREB、ATF-2和ATF-3结合位点是强心苷诱导AREG基因表达的主要顺式作用元件。有趣的是,ouabain也能延迟AREG mRNA降解作用,暗示ouabain可能在转录后水平也能调控AREG的表达。文献报道在紫外线诱导下,RNA结合蛋白人抗原R(HuR)能够结合到AREG 3’-UTR,保护AREG mRNA延缓降解。但在本实验中,干扰HuR表达后,ouabain对AREG表达的激活作用反而更加显著;过表达HuR,ouabain激活AREG明显下调。该结果表明HuR可能发挥去稳定AREG mRNA作用。而本课题组前期研究工作发现,ouabain通过结合细胞膜钠钾ATP酶,能诱导HuR出核,稳定细胞因子mRNA并促进细胞因子表达。所以本课题主要目的为,通过探讨ouabain调控AREG表达的作用机制,阐明ouabain-钠钾ATP酶信号通路与HuR介导的信号通路之间的关系。Ouabain-钠钾ATP酶的信号转导功能与Src激活密切相关。本研究发现ouabain能够诱导Src激酶磷酸化,并且Src激酶抑制剂PP2能够有效抑制ouabain激活AREG表达的作用,这表明ouabain通过诱导Src磷酸化进一步激活AREG表达。有趣的是,Src磷酸化不仅参与ouabain诱导的AREG转录激活,Src抑制剂PP2也能增强ouabain诱导的HuR出核作用。因此,Src在此发挥了双重作用机制,一方面通过转录激活促进AREG表达,另一方面通过调控HuR出核在转录后水平发挥作用。本研究的创新性在于(1)首次发现AREG在ouabain的上皮细胞保护作用中发挥作用,并初步解析ouabain调控AREG表达的分子机制;(2)首次将ouabain-钠钾ATP酶-Src经典通路与HuR介导的转录后调节机制联系在一起,拓宽了 ouabain新药理学作用机制。在今后研究中,将进一步深入探讨Src通路与HuR信号体Crosstalk在精密调节
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