HCN1通道基因敲除对小鼠膀胱Cajal间质细胞中BK通道的表达和功能的影响

作     者：孙碧韶 

作者单位：第三军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：宋波

授予年度：2015年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

主      题：Cajal间质细胞 逼尿肌过度活动 超极化激活环核苷酸门控阳离子通道 大电导钙激活钾通道 小鼠,基因敲除 膀胱 兴奋性 

摘      要：背景及目的:膀胱逼尿肌的兴奋性异常是临床上多种疾病如膀胱过度活动症(Overactive Bladder,OAB)、神经源性膀胱等的共同发病机制之一。阐明膀胱兴奋性调控的机制,对明确这些疾病的发病机制及临床诊疗具有重要意义。目前关于膀胱兴奋性调控的研究理论主要有神经源性和肌源性两大学说。膀胱中类似于胃肠道的自身可以起搏并产生兴奋的Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICCs)发现以来,肌源性学说日益得到重视和认可。研究发现膀胱ICCs上存在着多种离子通道和受体对其兴奋性进行调控,其中可引发起搏电流的超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(Hyperpolarization-Activated Cyclic Nucleotide-Gated Channels,HCN Channels)即HCN通道的发现,为ICCs作为兴奋起搏细胞的理论提供了可能的结构基础。M受体(Muscarinic Receptors)、P2X3受体(Purinergic P2X3 Receptors,P2X3 Receptors)等神经受体可接受来自神经的信号,参与ICCs兴奋性的调控。研究发现机械牵张也可调控ICCs的兴奋性。此外,研究证实,在膀胱逼尿肌细胞之间、ICCs与逼尿肌细胞之间存在存在着细胞间通讯。以上研究说明ICCs极有可能是膀胱自身源性的兴奋性调控机制的枢纽,它整合并传递来自神经、牵张刺激等调控信号,发起HCN通道起源的起搏电流信号,并通过多种离子通道、受体和细胞间通讯将兴奋传递至逼尿肌。这其中,HCN通道是核心,而与钙离子相关的多种离子通道参与并扮演了重要角色。HCN通道被普遍认为是起搏电流发起通道,其不同亚型在心脏起搏和神经节律调控中发挥重要作用。研究发现,人类和大鼠膀胱ICCs上都存在HCN通道并记录到其起搏电流If,且鼠类表达以HCN1通道为主。在大鼠逼尿肌过度活动(Detrusor Overactivity,DO)时,HCN通道的表达及功能升高。在膀胱中,HCN通道很可能担任兴奋起搏的角色,且与DO的形成有关。在与钙离子相关的离子通道中,大电导钙激活钾通道即BK通道(Large-Conductance Calcium-Activated Potassium Channels,BK Channels)本身对钙离子没有通透性,它引发的钾外流可负反馈性地抑制钙内流。在平滑肌细胞中,bk通道的激活可限制去极化,抑制收缩,调节平滑肌使其舒张。研究发现干预bk通道可影响膀胱兴奋性,其上调或下调均可导致不同类型的膀胱功能障碍。膀胱iccs中也有bk通道的表达,在do时,其表达及功能降低。bk通道参与了膀胱iccs的兴奋性调控,且与do的形成有关。hcn通道和bk通道存在着可能的顺承关系,两者都对iccs兴奋性的调节起着重要作用,干预hcn通道后bk通道的生理学改变是我们关注的内容。hcn1通道是鼠类膀胱中主要的hcn通道亚型,本文旨在研究hcn1通道基因敲除对小鼠膀胱iccs中bk通道的表达和功能的影响,并初步探讨这种影响对膀胱兴奋性调控的意义。方法1.本研究采用hcn1通道基因敲除(hcn1knockout,hcn1ko)c57bl/6j小鼠和hcn1通道野生型(hcn1widetype,hcn1wt)c57bl/6j小鼠作为实验对象,分别记为敲基因组和正常组。2.表达检测:通过反转录pcr(rt-pcr)、荧光定量pcr(q-pcr)实验在mrna水平检测敲基因小鼠膀胱中bk通道各亚基的表达变化;通过westernblot(wb)实验在蛋白水平检测敲基因小鼠膀胱中bk通道各亚基的表达变化;急性酶分离法分离培养膀胱原代iccs,通过免疫荧光双标实验进一步检测敲基因小鼠膀胱iccs中bk-α亚基的表达变化。3.功能检测:通过离体逼尿肌肌条实验比较敲基因组和正常组小鼠肌条的收缩功能,然后检测加入ibtx后小鼠肌条的收缩变化,比较敲基因组和正常组肌条收缩变化对ibtx的敏感程度以评价二者膀胱中bk通道的功能变化;急性酶分离法分离培养膀胱原代iccs,通过激光共聚焦显微镜下iccs内钙离子荧光采集实验检测分别加入ns1619和ibtx后钙荧光的变化,比较敲基因组和正常组iccs内钙荧光对ns1619、ibtx的敏感程度以评价二者iccs中bk通道的功能变化。结果***-pcr、q-pcr实验结果显示敲基因组小鼠膀胱中bk通道的α、β1、β2、β3、β4亚基表达均显著低于正常组(p0.01);***实验结果显示敲基因组小鼠膀胱中bk通道的α、β1、β2、β3、β4亚基表达均显著低于正常组(α、β3、β4:p0.01;β1、β2:p0.05);3.急性酶分离法分离后培养,得到活性良好的膀胱原代iccs;4.免疫