甘草SQS1基因多态性及其对产物积累的影响研究

作     者：呙未 

作者单位：北京中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘春生

授予年度：2010年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：甘草 基因多态性 基因共表达 鲨烯合酶 选择性剪切 

摘      要：甘草为常用大宗药材,其有效成分甘草酸(glycyrrhizie acid, GA)具有重要的药理学活性。但甘草酸含量不稳定,个体间差异较大的原因尚不清楚。本研究试图从甘草酸形成的基因机制来阐明甘草酸含量差异的原因。众多研究证明,由于基因的突变,导致氨基酸序列的变化,进一步引起酶活性发生变化,从而使得目标产物积累发生改变,因此可以从甘草酸合成过程中关键酶基因多态性的角度,探明甘草酸含量存在差异的内在基因因素。甘草酸是经甲羟戊酸途径合成的次生代谢产物,其合成途径中鲨烯合酶(squalene synthase, SQS)和β-香树脂醇合酶(β-amyrin synthase,βAS)起着的重要作用,催化形成p-香树脂醇,进一步氧化即可形成甘草酸。因此本研究将以上述两个关键酶作为对象,考察其对合成途径的影响。 其次,一个天然产物的生物合成途径,常常涉及15-20个酶,形成了一个代谢网络,而上下游的酶具有复杂的调控与反馈机制。现阶段大量关于生物工程的研究,都是通过构建一个完整的代谢途径来获得大量的目的产物,这过程中必定会涉及到多基因共表达,因此多基因共表达已成为研究的热点。而本研究则期望通过共表达上述两个基因,获得更多的p-香树脂醇。 因此,本课题拟采用同样条件下生长的人工栽培甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch),在系统分析功能基因序列和甘草酸含量关系的基础上,筛选出具有多态性的基因型,同时构建2个基因共表达的工程菌。研究基因多态性对产物积累的影响,验证多基因共表达增多产物的合成。为后续的甘草人工分子育种以及发酵技术大量生产甘草酸奠定基础。 本课题主要结论如下： 1.甘草植株在同一生长环境下甘草酸也存在显著差异,甘草酸含量从0.9087%到4.9164%不等。 2.甘草SQS1基因存在多态性,具有至少3种基因型。但通过聚类分析,发现该多态性与甘草酸含量无直接关系。这可能是由于甘草酸高低是由多个酶共同调控的,单个酶的作用有限,因此需研究整个代谢途径的多个酶共同作用机制。 ***1基因多态性对sQ,βA的积累都产生影响。通过将具有态性的SQS1基因分别导入酵母细胞中表达后发现不同基因型的SQS对鲨烯和下游的p As的基因产物-β香树脂醇存在影响。鲨烯的净增量分别是-0.0009mg/ml (-1.8%),0.0043mg/ml(8.6%),0.004mg/ml(8.0%);β香树脂醇的净增量分别是0,0.0025 (50%),0.0007 mg/ml (14%).由此可见优良的SQS1基因型对下游的β香树脂醇含量产生较大的影响,SQ的积累有助于βA的合成。 4.基因共表达能够增强产物的合成。优良基因组合影响下游基因的催化产物含量,特别是将SQSl,βAS两个基因共表达后生成βA最高的bSd2P菌株是只导入了bP菌株的1.5倍,也是最低的bSd1P菌株的1.5倍。说明优良基因共表达能够获得更多的目的产物。 5.甘草SQS1基因存在选择性剪切体,但是该现象对于甘草酸的影响及作用机制均待于进一步的研究。