定量检测tPSA和fPSA荧光免疫层析方法的建立

作     者：钱存 

作者单位：郑州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王云龙

授予年度：2017年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：荧光微球 免疫层析 定量检测 总前列腺特异性抗原 游离前列腺特 异性抗原 

摘      要：背景前列腺特异性抗原(Prostate specific antigen,PSA)由前列腺上皮组织分泌,分子量为34KD,已广泛应用于前列腺癌的辅助诊断,免疫学方法检测形式有两种,即游离前列腺特异性抗原(free-PSA,f PSA)、与α1-抗糜蛋白结合的前列腺特异性抗原(PSA-ACT),通常所说的总前列腺抗原(t PSA)是f PSA和PSA-ACT的总和。国际上认为,PSA浓度小于4ng/m L是正常水平,前列腺癌风险随PSA浓度升高而增加,当PSA浓度在4～10ng/m L之间时被认为是诊断灰区,t PSA和f PSA占t PSA百分比(%f PSA)常用来提高诊断灰区的前列腺癌诊断效率。定量检测t PSA和f PSA的方法主要有:化学发光法、时间荧光免疫分辨法、电化学发光法等,这些方法虽然具备灵敏度高、定量准确、重复性和稳定性较好等优点,但是需要大型仪器,适合样本量多的大中型医院,不适合单个标本测定,从而限制了t PSA和f PSA检测项目在社区医院的开展。目前国内检测t PSA和f PSA的试剂盒中,缺少一种可以准确、快速定量,并且操作简便可实现床旁检测方法,荧光微球免疫层析技术可实现床旁检测,如能研究成功,可弥补国内t PSA、f PSA检测方法的缺憾。目的建立一种性能优良的定量检测t PSA及f PSA的方法,为t PSA及f PSA的检测提供一种新的技术和方法。方法应用t PSA及f PSA蛋白制备室内参考品;用荧光微球与抗体偶联,并利用中心提供的荧光免疫层析实验技术和平台对本实验条件进行多方面的研究和优化。通过分析试纸条的最低检出限、特异性、准确度、线性、精密性以及稳定性,对其性能进行研究。取已经过罗氏试剂盒(电化学发光法)定值的血清87份,用本实验建立的检测方法进行测定,比较两种检测方法的相关性。结果研究结果显示,本实验制备的t PSA及f PSA室内参考品在≤-20℃环境下至少能够稳定保存12个月,2-8℃环境下至少能够稳定保存4周;本试验制备的试纸条t PSA的最低检出限为0.08ng/m L,f PSA的最低检出限为0.06ng/m L;与CEA、AFP、CA125均无交叉反应;试纸条批内变异系数均小于10%,批间变异系数均小于15%,回收率在97.06%-103.11%之间;试纸条在2-8℃储存条件下至少可稳定存放6个月,37℃储存条件下可稳定存放10天;用本实验建立的荧光免疫层析试纸条与罗氏试剂盒(电化学发光法)进行相关性分析,检测t PSA的R2为0.9727,回归方程为Y=0.9372X+0.2626,检测f PSA的R2为0.9888,回归方程为Y=0.9981X-0.0537,两种检测方法具有良好的相关性。结论(1)制备出稳定的t PSA、f PSA室内参考品;(2)初步建立了同时检测t PSA、f PSA荧光层析定量检测方法。(3)制备了性能良好的t PSA、f PSA荧光层析定量检测试纸条。