rhBMP-2结合胶原膜在兔颅骨引导骨再生模型中的成骨效应研究

作     者：赖春花 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：周磊

授予年度：2010年

学科分类：08[工学] 080501[工学-材料物理与化学] 0805[工学-材料科学与工程（可授工学、理学学位）] 080502[工学-材料学] 

主      题：引导骨再生 骨形态发生蛋白 胶原膜 钛筒 

摘      要：研究背景： 近年来,随着口腔种植外科技术提高和生物材料的发展,口腔种植学迅猛发展。然而,骨量不足仍然是种植义齿面临的一个主要问题,大量的牙种植病员都需行骨增量手术解决此问题。但骨增量的成功与否很大程度上依赖于骨代用品材料的引导骨再生的效能。因此,人们努力通过科学研究提高骨代用品的骨引导及骨诱导能力促进骨生成作用。 骨形态发生蛋白2 (bone morphogenetic protein2, BMP-2)是已知的所有生长因子中对骨的形成作用最强的生长因子。然而,rhBMP-2作为酸性多肽,易在体液中快速扩散,也容易被蛋白酶所分解,治疗浓度难以维持,不能持续刺激靶细胞以充分发挥其诱导活性。学者们曾尝试通过提高rhBMP-2的使用剂量来促进成骨,然而,rhBMP-2的剂量太高,也会产生一系列并发症,可能导致组织肿胀、增加炎症反应的发生,阻碍了新骨形成;可能促进不期望的异位骨生成,还可在骨痂内形成囊肿样病变。而且,rhBMP-2的半衰期较短,价格昂贵。所以,目前的研究热点是将rhBMP-2吸附、粘接、载负于载体上,建立稳定的rhBMP-2释放系统,减少rhBMP-2的使用剂量,减少rhBMP-2的渗漏以提高植入位点局部浓度,降低并发症的发生率,使rhBMP-2的使用效能最优化。 中国科学院Jianwu Dai等人发现：将一段含七个氨基酸的寡钛即胶原结合域(collagen-binding domain, CBD)和rhBMP-2的N端结合,形成具有胶原靶向结合能力的rhBMP-2,简称rhBMP2-h。C2C12细胞培养实验结果提示：rhBMP2-h的生物活性没有降低。体外胶原结合实验证实了rhBMP2-h能与胶原牢固紧密结合,而传统的rhBMP-2与胶原复合后经大量PBS冲洗时大部分rhBMP-2流失。 在种植临床实践中,骨量不足特别是牙槽骨高度及宽度不足常导致种植体植入困难甚至无法植入,临床医生常用引导骨再生术实现牙槽嵴的骨增量。引导骨再生术是指用屏障膜维持手术建立的空间,阻挡增值快速的纤维组织的长入,以保证增值速度较慢的成骨细胞和血管从牙槽嵴顺着骨粉往上生长。临床上所用屏障膜主要是胶原膜,它起机械性阻挡和隔离的作用,不具备主动诱导作用,当临床上牙槽嵴缺损较多时,只从牙槽嵴顶往上成骨使骨增量效果欠佳。 目的： 鉴于以上的问题,本研究将具有与胶原靶向结合能力的rhBMP-2复合到胶原膜上,形成有骨诱导性的胶原膜,研究其在兔颅骨引导骨再生动物模型中的成骨效应,为有效使用生长因子提高成骨效应提供理论依据及实践参考。 方法： 1.用纯钛棒机械加工成一定规格的钛筒,充分抛光后进行多次超声及化学试剂表面清洗,分装、高温高压消毒、干燥备用。 2.实验动物及分组： 选用5-6月龄,体重为2.7-3.2kg,普通级雌性健康新西兰大白兔45只。 实验动物分组： 每只兔颅顶骨可植入四个钛筒,本实验四个处理组,分布在同一个动物身上。四个钛筒均装骨粉到肩台水平,A组：盖rhBMP2-h/胶原膜;B组：盖游离rhBMP-2/胶原膜;C组盖胶原膜;D组不盖膜。 用45只新西兰大白兔进行造模实验,其中5只兔出现钛筒松动,不纳入统计分析。剩余40只兔完全随机分成1、2、3、4四个组,每组10只。第1组实验时间2周,第2组实验时间4周,第3组实验时间6周,第4组实验时间12周。 每个时间段每个处理组有10个样本量。 其中8个样本进行塑料包埋亚甲基蓝-酸性品红染色后做骨组织学观察和计量学分析,2个样本进行石蜡包埋HE染色行组织学观察。 3.手术过程及动物模型建立： 手术方法：每只兔的颅骨上制备四个环形骨裂隙,通过钛筒自身的螺纹旋转攻入骨内从而将钛筒固定,植入骨粉,四个钛筒顶端分别给予盖rhBMP2-h/胶原膜、游离rhBMP-2/胶原膜、胶原膜或者不盖膜。缝合关闭创口,术后3天均肌注青霉素40万单位以预防感染,单独喂养。于处死前13日、14日颈部皮下注射四环素,而处死前3日、4日颈部皮下注射钙黄绿素。40只实验动物分别于2、4、6、12周各处死10只,将钛筒连同颅骨完整取下并修整后以10%中性福尔马林固定,制作硬组织切片及石蜡切片。硬组织切片用亚甲基蓝-酸性品红染色,石蜡切片HE染色。骨磨片荧光显微镜下观察。亚甲基蓝-酸性品红染色的切片行组织形态学及计量学观察,通过图像测量软件获取相关实验数据资料,把不同组间的实验数据进行统计学对比分析后,得出相应的实验结论。HE染色行组织形态学观察。 结果： 1.实验动物术后生长恢复良好,各组动物均无死亡,伤口无炎症无裂开,每只兔植入4个钛筒,4