PDGF-BB在巨核系造血及调控骨髓间充质细胞TPO生成的研究

作     者：毛利靖 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨默

授予年度：2017年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：血小板衍生因子 巨核细胞 增殖 凋亡 骨髓间充质细胞 血小板生成素 

摘      要：研究背景与研究目的血小板衍生生长因子(PDGF)是一种多肽生长因子,其储存于人血小板α颗粒中。PDGF家族有5个不同的二聚体,PDGF-AA,AB,BB,CC和DD,其通过结合PDGFα受体和β受体发挥其生物学功能。PDGF受体(PDGFR)是一种跨膜糖蛋白,由α和β两种酪氨酸蛋白激酶亚基构成,具有酪氨酸蛋白激酶活性。研究发现,PDGF-BB与两种受体高亲和力结合后,促增殖作用比其他亚型更强。PDGF-BB可以促进多种结缔组织细胞如成纤维细胞,内皮细胞和平滑肌细胞等的生长和分化。除此以外,PDGF-BB对造血也具有重要的作用,如促进红系爆式集落形成单位(BFU-E)和粒系-红系-单核-巨核细胞集落形成单位(CFU-GEMM)的形成。然而,PDGF-BB在造血中的具体机制尚不明确,可能与骨髓微环境中的骨髓间充质细胞TPO的生成有关。因此,本研究旨在探索PDGF-BB对CFU-MK形成的作用,并将其与IL-3、IL-6、TPO和GM-CSF的作用进行对比,以及加入抗IL-3、IL-6或TPO单克隆抗体后对CFU-MK生成的影响。进一步探讨PDGF-BB促进巨核系造血的作用机制:PDGF作用于骨髓间充质细胞表面的PDGF受体,激活下游相关的转录因子调控TPO产生,从而间接调节骨髓巨核系造血。研究内容与研究方法第一部分PDGF-BB促进巨核细胞生成一、PDGF-BB对小鼠CFU-MK集落形成的影响1.检测不同浓度的 PDGF-BB(0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)对小鼠CFU-MK形成的影响;2.检测不同细胞因子(PDGF-BB、IL-3、IL-6、GM-CSF及TPO)及其不同组合对小鼠CFU-MK的作用;3.加入抗IL-3、IL-6、或TPO抗体后研究PDGF-BB对小鼠CFU-MK形成的影响。二、PDGF-BB对人CFU-MK集落形成的作用检测不同浓度 PDGF-BB(0 ng/ml、5 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml)对人类 CFU-MK的作用。第二部分PDGF作用于骨髓间充质细胞调控TPO产生1.CCK-8法检测PDGF对人MSCs的增殖作用;2.Annexin-V/PI染色法检测PDGF对人MSCs凋亡的影响;3.流式细胞术检测人MSCs细胞表面PDGFR-β的表达;4.Western blot检测PDGF-BB对骨髓间充质细胞MAPK/ERK、STAT信号通路的影响;5.Q-PCR 检测 PDGF-BB 对人 MSCs TPO mRNA 表达水平。研究结果第一部分PDGF-BB促进巨核细胞生长一、PDGF-BB对小鼠CFU-MK集落形成的影响1.PDGF-BB以剂量依赖的方式促进小鼠CFU-MK的形成,其中50 ng/ml作用最为明显(n=5,P0.05),但是IL-3+IL-6对CFU-MK的增殖具有明显的协同作用,是单独作用的2倍(n=5,P0.00001);4.PDGF-BB+IL-3 MoAb组与单用PDGF-BB组相比,CFU-MK计数无显著差异(n=4,P=0.127);而 PDGF-BB+IL-6MoAb 组的 CFU-MK 数量减少了53.8%(n=4,P=0.003);PDGF-BB+TPOMoAb 组减少了 51.2%(n=4,P=0.002)。二、PDGF-BB对人CFU-MK形成的作用PDGF-BB以剂量依赖的方式促进人CFU-MK的增殖,其中50 ng/ml作用最为明显(n=4,P0.001)。第二部分PDGF作用于骨髄间充质细胞调控TPO产生间接促进骨髓造血生成1.PDGF-BB促进人MSCs的增殖,最适浓度为50 ng/ml(n=8,P=0.0027);2.PDGF-BB能够显著减少MSCs的凋亡(n=5,P=0.00004);3.Q-PCR结果显示,MSCs高表达PDGFR-β mRNA;流式结果显示,MSCs表达PDGFR-β;4.Western blot结果显示,PDGF-BB处理组的骨髓间充质细胞P-ERK、P-STAT3蛋白表达增加;5.PDGF-BB 处理 MSCs 后,TPO mRNA 表达水平显著增高(n=7,P=0.021)。研究结论1.PDGF-BB可以显著促进小鼠和人CFU-MK的形成;2.PDGF-BB对MSCs有促增殖和抗凋亡作用,MSCs高表达PDGFR-β,其与PDGF-BB结合后激活下游MAPK/ERK、STAT信号通路;3.PDGF-BB作用于骨髓微环境中的骨髓间充质细胞,在转录水平促进TPO产生,间接促进巨核系造血。