TIPE3的表达特点及其对肿瘤细胞生存和迁移的影响

作     者：孙越 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张利宁

授予年度：2014年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：TIPE3 肿瘤组织 食管癌 非小细胞肺癌 免疫组化 

摘      要：研究目的 已知癌基因和抑癌基因在肿瘤的发生和发展中发挥重要作用,发现新的癌基因或抑癌基因对肿瘤的诊断或治疗有潜在的价值。TIPE (tumor necrosis factor-α-induced protein8, TNFAIP8)家族是近几年新发现的与肿瘤相关的一组基因,由TIPE、TIPE1、TIPE2和TIPE3组成,它们具有高度同源性,均包含有7个保守的α螺旋(α0-α6)结构,已有研究结果提示TIPE、TIPE1和TIPE2在多种肿瘤中发挥癌基因或抑癌基因样作用,但作为TIPE家族的新成员--TIPE3的特性和在肿瘤中的作用尚未见报道。 为了研究TIPE3的表达特点和在肿瘤中的可能作用,本课题制备了人TIPE3的多克隆抗体并对其特异性进行鉴定;然后通过免疫组化的方法,利用所制备的抗体及正常组织芯片和常见肿瘤芯片,分析了TIPE3在人正常组织、肿瘤组织的表达谱;并对TIPE3表达有明显差异的两种肿瘤-非小细胞肺癌和食道癌进行重点研究,分析了TIPE3在癌和癌旁表达的差异及与临床病理参数的关系;最后,在体外,利用所构建的长、短及截断三种人TIPE3表达载体检测其对肿瘤细胞恶性行为(细胞增殖、细胞周期和细胞迁移)的影响,初步结果提示TIPE3具有癌基因样的作用。 实验方法： 1.标本：①人正常组织芯片：含有肝、肺、肾等18种个人正常组织;②多种肿瘤芯片：含有肺癌、食道癌和肝癌等10种肿瘤组织和相应的癌旁组织,每种3例;③非小细胞肺癌及癌旁组织芯片(58例)④食道癌及其癌旁组织芯片(29例)。 2.人TIPE3真核表达载体的构建：以人TIPE3基因的克隆载体(pFL-B02cl)为模板,设计不同引物通过PCR得到相应目的片段并将其插入到pflag-cmv-2载体中,分别得到长(long-TIPE3)、短(short-TIPE3)和N末端截断(truncated-TIPE3) TIPE3重组载体。 3. TIPE3多克隆抗体的制备：设计并合成抗原表位,与载体和佐剂混合后,多次免疫家兔制备兔抗人TIPE3多克隆抗体。4. Western Blot检测：裂解细胞后收取蛋白,SDS-PAGE电泳,PVDF膜印迹,TIPE2、TIPE3一抗孵育后,ECL显色检测蛋白表达。 5、免疫组织化学：所制备兔抗人TIPE3多克隆抗体作为一抗,辣根酶标记羊抗兔二抗孵育,DAB显色检测芯片组织中TIPE3蛋白的表达情况。 6、细胞活力检测(CCK8法)：将TIPE3载体转染进肿瘤细胞后,分别于0h、24h、48h和72h通过检测细胞线粒体中脱氢酶的甲瓒还原记录细胞活力。 7.流式细胞术：细胞用胰酶消化成单个细胞后,加入PI染色后,流式细胞仪分析细胞周期。 8、细胞迁移检测(Transwell法)：将空载体或三种TIPE3重组载体转染肿瘤细胞24h后,制备单细胞悬液,置transwell上层,检测细胞从上层向下层的迁移能力。 9、统计学方法：应用非参数秩和检验(Wilcoxon检验)、卡方检验等分别对结果进行统计。 结果： 一.构建了含人TIPE3两个异构体(长和短)及N-末端截断的真核表达载体 人TIPE3有两个异构体-长(292aa)、短(204aa),短型N末端有一个与TIPE2不同的结构域(这里简称N端结构域),我们分别构建了三种表达载体,即长TIPE3载体(long-TIPE3)、短TIPE3载体(short-TIPE3)和N端结构域被截断的TIPE3载体(truncated-TIPE3)并通过酶切电泳验证载体构建成功。 二、TIPE3多克隆抗体制备及其特异性鉴定 1、制备了兔抗人TIPE3的多克隆抗体：设计并合成TIPE3特异性抗原表位,与载体结合后,多次免疫兔制备兔抗人TIPE3特异性抗体,抗体滴度1：400。 2. TIPE3抗体的特异性分析：为明确所制备抗体的可行性及特异性,我们将人TIPE2、TIPE3载体分别转染进入293细胞,分别用TIPE2、TIPE3抗体进行Western Blot检测。结果显示在用TIPE2抗体染色时,只在转染TIPE2组可见TIPE2的表达带,转染TIPE3及对照组均未显示有TIPE2条带;而用TIPE3抗体染色时,只在TIPE3组出现一明显的条带,分子量与预测的基本一致,转染TIPE2及对照组均未见相同大小条带,说明该条带即为人TIPE3蛋白的特异性条带,所制备的TIPE3抗体与TIPE2无交叉反应,特异性较高。 三、TIPE3在人正常组织中的表达谱 (一)表达部位 TIPE3主要分布在细胞膜和细胞浆,胞核未见有TIPE3的阳性表达。 (二)表达特点 1. TIPE3在被覆上皮中的表达情况：由芯片结果可见,在单层扁平细胞,如肺泡上皮中,未见TIPE3表达;但在具有分泌功能的胰腺、汗腺和前列腺等导管单层立方上皮细胞中呈现TIPE3的明显高表达,肾小管和胆管上皮细胞中也明显高表达,但甲状腺单层滤泡上皮细胞、卵巢及肾上腺细胞中却未见其表达;在单层柱状上皮中,胃、小肠、大肠等黏膜上皮细胞中可见有TIPE3蛋白明显高表达。 2. TIPE3在实质器官中的表达情况：在肝细胞中可见TIPE3低表达,而在肌组织(骨骼肌和心肌)及脑组织(大脑和小脑)细胞中却呈现广泛的高表达状态。 四、TIPE3在人肿瘤中的表达特点及其临床意义 一、TIPE3在肿瘤中的表达谱-芯片 TIPE3在肿瘤中的表达谱：为了分析TIPE3与肿瘤的可能关系,我们采用免疫组化的方法,分析了TIPE3在组织芯片上的10种肿瘤的中的表达,结果发现TIPE3某些肿瘤组织中的表达高于其癌旁组织,提示其与肿瘤的生长代谢密切相关。 二、TIPE3在食道癌中的表达和临床意义 (一)TIPE3在癌旁和癌中表达的差别 TIPE3蛋白在食管癌癌组织中的表达高于相应癌旁组织,差异有统计学意义(p0.0001]。 (二)TIPE3在食管癌中的表达与临床病例资料的相关性分析 将肿瘤芯片中食管癌患者的临床病理资料进行分类整理,发现随着食管癌患者肿瘤组织病理分级的增加,TIPE3表达程度也相对增加。 三、TIPE3在非小细胞肺癌中的表达和临床意义 (一)TIPE3在癌旁和癌中表达的差别 TIPE3蛋白在非小细胞肺癌癌组织中的表达高于其癌旁组织,差异有统计学意义(p0.0001]。 (二)TIPE3在非小细胞肺癌组织中表达强度与临床病例资料相关性分析 我们将芯片中患者的病理资料分别进行分类,TIPE3在肺癌组织中表达的强度与患者年龄、性别和TNM分期均未发现有明显的相关性。 (三)TIPE3膜型、浆型表达及其与临床病例资料的相关性分析 根据TIPE3蛋白在肺癌组织中表达部位的不同,将TIPE3表达分为浆型和膜型两种类型,统计分析发现膜型TIPE3表达在T2-T3期患者中所占比例高于T1期患者。 第四部分TIPE3对肿瘤细胞恶性行为的影响 一、三组TIPE3质粒在肿瘤细胞(HepG2)中转染效率的检测 为了后续研究TIPE3对肿瘤细胞恶性行为的影响,我们首先将三组TIPE3质粒转染进入肿瘤细胞,收取细胞蛋白后检测相应TIPE3蛋白的表达情况,结果显示三组过表达TIPE3质粒细胞都检测到相应TIPE3蛋白的表达,即质粒转染效率较高。 二、TIPE3对肿瘤细胞增殖的影响 为研究TIPE3对肿瘤细胞生长的影响,我们用长、短和截断的TIPE3重组表达载体分别转染肿瘤细胞系,于转染后Oh、24h、48h及72h用CCK8方法检测细胞活力。结果发现长型TIPE3对肿瘤细胞的生长无明显影响,但短型TIPE3明显促进肿瘤细胞的增殖,N端截断后不仅其促细胞增殖的作用消失,反而出现抑制效应,提示短型TIPE3可能在肿瘤中更重要,且N端功能域起关键作用。 三、TIPE3对细胞周期的影响 为研究TIPE3对肿瘤细胞周期的影响,我们将细胞种板,转染48小时后通过PI染色检测不同转染组细胞周期的改变。结果发现转染空载体组和TIPE3载体组细胞相比,细胞周期未见有明显改变。 四、TIPE3对细胞迁移的影响 为研究TIPE3对肿瘤细胞迁移能力的影响,我们用长、短和截断TIPE3重组表达载体分别转染肿瘤细胞系,转染24小时后,将细胞转移到transwell小室,分析细胞迁移能力。结果发现结果长型TIPE3对细胞的迁移能力没有明显的影响,但短型TIPE3明显促进肿瘤细胞的迁移,N端截断后其促细胞迁移的作用消失。说明短型TIPE3具有促进肿瘤细胞迁移的作用,且N端功能域起关键作用。结论 1、成功制备了兔抗人TIPE3的特异性多克隆抗体,其与人同家族TIPE2蛋白之间没有交叉反应。 2、人TIPE3在正常组织中有较广泛的分布,主要高表达于立方上皮和柱状上皮细胞、肌细胞及脑细胞中;在肿瘤组织中的表达因组织类型的不同而有所差异;在非小细胞肺癌及食道癌癌组织中的表达明显高于其相应癌旁组织,提示在这两种肿瘤中发挥更重要的作用。 3、短型人TIPE3具有癌基因样作用,它的过表达可明显促进肿瘤细胞的增殖和迁移能力,其N端结构域对其功能是必须的。长型TIPE3作用不明显。创新性及意义 1、首次制备了特异性抗体,明确TIPE3分别在人多种正常组织及肿瘤组织(特别是在肺癌和食道癌)中的表达特点,为TIPE3的功能研究奠定了基础。 2、通过临床标本和体外实验初步确定短型人TIPE3具有癌基因样作用,其N端功能域是其功能所必须的,而长型作用不明显,以上为研究TIPE3在肿瘤中的作用和机制提供了线索。