羧甲基壳聚糖对大鼠单一心房肌细胞超速激活延迟整流钾电流的作用

作     者：宋志国 

作者单位：中国医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李金鸣

授予年度：2004年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：羟甲基壳聚糖 膜片钳技术 心房 心肌 钾通道 超速激活延迟整流钾电流 

摘      要：前言 房颤(atrial fibrillation，AF)是临床上最常见的持续性心律失常，也是危害人类健康的重要疾病。目前，AF的形成机制尚无定论，大量临床实践和流行病学研究表明，心房电重构对房颤的发生和维持起重要作用，因而抑制通道重构是治疗AF的热点之一。 心房电重构会对复极电流产生重要影响，钾通道电流是心肌动作电位复极的主要电流，所以钾通道电流是AF的重点研究对象。超快速激活型(ultrarapid delayed rectifier potassium current，I)是一种延迟整流钾电流(delayed rectifier potassium current，I)，它在心房肌中表达较多，而在心室肌中表达很少或不表达，选择性抑制I将可能把对AF的治疗作用与作用于心室的致心律失常作用完全分离开来，从而达到有效而安全的治疗目标。因此，高效、特异性的I阻断药在抗AF等房性心律失常方面有着重大意义。 甲壳质广泛存在于甲壳类动物、昆虫和其它无脊椎动物的外壳中。壳聚糖是甲壳质脱去乙酰基的产物。实验表明壳聚糖具有抗感染、抗肿瘤、防治高血压和抗心律失常等方面的作用。羧甲基壳聚糖(carboxymethyl chitosan，CMCS)是壳聚糖经羧甲基化而得的一种水溶性多糖，本实验以前的实验曾观察到CMCS具有抑制豚鼠单一心室肌细胞延迟外向钾电流的作用，本实验应用膜片钳技术首次研究CMCS对大鼠单一心房肌细胞I的作用，进一步揭示其在心血管尤其抗房性心律失常方面的作用机制。 实验方法 1．大鼠单一心房肌细胞的制备 Wistar大鼠，200～250 g，雌雄不限，中国医科大学实验动物部提供。戊巴比妥钠20 mg·kg腹腔麻醉，取出心脏，主动脉插管，在37℃恒温和供氧条件下用Langendorff装置进行灌流。用二步酶解法分离出单个心房肌细胞，当数量最多、质量最好时收集细胞。将分离的心房肌细胞放在KB液 中，置于4℃冰箱稳定lh后即可使用。 2.膜片钳制技术全细胞模式记录IKur 将分离的心肌细胞置于容积1. smL平放于倒置显微镜上的浴槽中，挑 选表面光滑，横纹清晰，无收缩的心房肌细胞行千兆封接，全细胞状态形感 后，用pCLAMPS.5·‘软件程序对细胞发放刺激并记录电流信号轨迹。铎 文献方法，采用经典的双脉冲刺激方案获得‘Ku一即首先给一个时程为乡叩 ms，保持电位一60 mV，去极化到+30mV的条件脉冲，间隔20Ins后，再给 予波宽1200 ms的方波刺激，保持电位一60mV，刺激电压从一40mV一+50 mv，步阶电压 10 mV。当记录的电流稳定后(1一2而n)开始累积给药观察 电流的变化并实时记录。 3.统计分析一 记录的电流在pCLAMPS .5 .1中进行分析和电流大小的测量.。IKur的幅 度是刺激结束时相对于零电流水平的幅值，实验结果用又士s表示，实验数 菇死理是将细胞给药前后的电流值进行配对资料t检验，P。.05为有统 计学意义。 实验结果 CMCS抑制IKur，当其浓度为1和29·L一，时，指令电位+50 mV的电流 值分别由给药前的(1.8士O .7)和(2.0土0.6)nA下降(14土6)%(n二 12，P0 .01)和(23土3)%(n二7，P0.01)。 其他指令电位下的IKur的改 变也符合此趋势。增加刺激频率及指令电压IKur 的变化均不显著，提示 cMCs对IKur的抑制作用木具有电压依赖性和频率依赖性。 讨论 1.膜片钳技术及其在心血管研究中的应用 膜片钳技术是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一 的(或多个的)离子通道分子活动的技术。 该技术是对细胞和分子水平的 生理学研究方法的一次革命，使昔日“肉汤生理学(broth physiofo留)与“闪 电生理学(lightuing physiology)在分子水平上结合起来， 使人们对膜通道 的认识耳目一新。全细胞记录(whole一eeu recording)是膜片钳技术的一种 记录方式，近年来在研究离子通道的变化对细胞功能的影响，以及在药物作 用机制的研究中被广泛采用。 随着膜片钳技术在心血管方面的广泛应用，为了解不同疾病机理，为研 制新的更为特效的药物开辟了道路。本实验应用膜片钳技术研究了CMCS 对大鼠单一心房肌细胞IKur的作用，阐明了其在抗房性心律失常方面的作用 机制。 2.大鼠单一心房肌细胞的制备 心房肌细胞直径明显小于心室肌细胞，高阻封接的难度要大于心室肌， 因而对单个心房肌细胞质量的要求更高。目前关于心肌(心房肌和心室 肌)细胞分离的技术已经成熟，但取得数量多、活性好的细胞还是不容易 的，本实验按文献方法，经两次消