重组白介素10与肝细胞生长因子融合基因表达载体的构建及其在肝星状细胞内的表达

作     者：谢小明 

作者单位：南华大学 

学位级别：硕士

导师姓名：徐海帆

授予年度：2011年

学科分类：1002[医学-临床医学] 1010[医学-医学技术（可授医学、理学学位）] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 100215[医学-康复医学与理疗学] 10[医学] 

主      题：白介素10 肝细胞生长因子 融合基因 表达载体 肝星状细胞 

摘      要：目的（1）构建携带白介素10、肝细胞生长因子以及二者融合基因的重组表达载体并对其进行测序;（2）将含白介素10、肝细胞生长因子以及二者融合基因的重组表达载体转染至肝星状细胞LX-2内,并检测各组LX-2内IL-10和HGF的表达情况;（3）同时比较含IL-10、HGF和IL-10-HGF融合基因的表达载体对LX-2增殖的影响。 方法分别以含有IL-10和HGF基因的质粒puc57-IL10、pBluescript II-SK（+）-HGF为模板, PCR扩增得到IL-10、HGF的基因片段,与T-载体连接,得到T-HGF,测序正确后酶切,与双酶切的表达载体pcDNA3.1进行连接,获得阳性克隆IL-10、HGF的表达载体pCDNA3.1-IL-10和pCDNA3.1-HGF;采用重叠PCR技术扩增IL-10-HGF的融合基因片段,并亚克隆至表达载体pcDNA3.1,经酶切和测序验证后获得含有IL-10-HGF融合基因的表达载体pcDNA3.1-IL-10-HGF;大量制备各基因的表达载体以及空载体pCDNA3.1;将各基因的表达载体转染肝星状细胞LX-2,RT-PCR检测各组细胞中IL-10、HGF基因的转录情况,Western Blot检测各组细胞中IL-10、HGF的蛋白表达情况,MTT法检测24h、48h、96h各组细胞的增殖情况,分析融合基因表达对细胞增殖能力的作用。 结果（1）成功构建携带白介素10、肝细胞生长因子以及二者融合基因的重组表达载体pCDNA3.1-IL-10、pCDNA3.1-HGF和pCDNA3.1-IL-10-HGF;（2）RT-PCR检测结果显示,各组细胞中均检测到IL-10、HGF基因的转录,而基因转染组细胞相应的目的基因转录水平有显著提升,表明转染组中各目的基因表达增强;（3）Western-blot检测结果显示,pCDNA3.1-IL-10转染组和pCDNA3.1-HGF转染组均可检测到IL-10和HGF的表达,而pCDNA3.1-IL-10-HGF转染组检测的蛋白约为105kD,符合IL-10-HGF蛋白的大小;（4）MTT结果示,pCDNA3.1-IL-10转染组、pCDNA3.1-HGF转染组和pCDNA3.1-IL-10-HGF转染组在转染后24h、48h、96h较空白对照组对LX-2的增殖均有抑制作用（#P0.05,有统计学意义）,但pCDNA3.1-IL-10-HGF转染组对LX-2的增殖抑制作用较pCDNA3.1-IL-10转染组、pCDNA3.1-HGF转染组更明显（*P 0.05、◆P 0.05,有统计学意义） ,而pCDNA3.1-IL-10转染组和pCDNA3.1-HGF转染组之间无差异（P0.05,没有统计学意义）。 结论（1）成功构建携带白介素10、肝细胞生长因子以及二者融合基因的重组表达载体pCDNA3.1-IL-10、pCDNA3.1-HGF和pCDNA3.1-IL-10-HGF;（2）携带白介素10、肝细胞生长因子以及二者融合基因的重组表达载体pCDNA3.1-IL-10、pCDNA3.1-HGF和pCDNA3.1-IL-10-HGF均能在肝星状细胞LX-2内表达且对其增殖产生抑制作用,且后者对其抑制作用较前两者更明显。关键词白介素10肝细胞生长因子融合基因表达载体肝星状