臭氧治疗对糖尿病足影响及作用机制研究

作     者：张净 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：薛耀明

授予年度：2013年

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：臭氧 糖尿病足 血管内皮生长因子VEGF 转化生长因子TGF-β 血小板源性生长因子PDGF 

摘      要：研究背景 糖尿病是严重危害人体健康的一种慢性疾病,其患病率在全球范围内逐渐上升。Wild S曾经预计到2030年,全球糖尿病患病率将达到4.4%,糖尿病患者的数目将达到3.66亿。世界卫生组织和国际糖尿病联合会预测,世界上糖尿病人口将在未来15年的增加一倍,在发展中国家患病人数增加比例将会更大。而中国糖尿病发病率增加尤为惊人,杨文英等教授总结和分析了2007年到2008年间中国糖尿病流行病学调查数据,结果显示：中国成人糖尿病发病率达致9.7%,糖尿病前期发病率为15.5%,大约1/4的中国成人处于血糖不正常的状态.,比2000年-2001年全国糖尿病发病率增加4.2%。随着糖尿病患病率增加,糖尿病慢性血管并发症也随着升高,已成为糖尿病患者致死致残的主要原因。 糖尿病足是糖尿病的严重并发症之一,国际上一直在通用的糖尿病足的定义,是Oakley于1956年首先提出来。1999年世界卫生组织(WHO)的定义是[3].糖尿病足(diabetic foot,DF)是指患者因高血糖所致的足部感染、溃疡及深层组织破坏,并且这些变化与下肢远端神经异常及伴有不同程度的周围血管病变有关。随着近年来糖尿病发病率的逐年升高,我国有12%-25%的糖尿病患者并发糖尿病足,它严重影响患者生活质量,甚至危及生命。有流行病学资料表明：糖尿病足约占糖尿病患者的4%-10%,是目前糖尿病致残、致死的主要原因之一。据调查统计显示,全世界每年做截肢手术的患者中有50%的是糖尿病足患者,糖尿病患者在其一生中出现足溃疡的概率为15%,且随着年龄的增长病程有延长的趋势。85%的足部溃疡最终需要截肢,糖尿病患者截肢后1年病死率为1%-41%,3年为20%-50%,5年为39%-69%。可见,截肢将会严重影响患者的长期生存率。糖尿病足特点是病程比较长、治愈较困难、患者心理负担和经济负担比较高,其致残率致死率比较高,对糖尿病患者威胁非常严重。临床上,糖尿病足与普通慢性创面不同,慢性难愈,因素复杂,给患者身体和精神上带来巨大的痛苦,也给家庭和社会造成严重的影响和负担[4]。因此,糖尿病足创面的治疗也显得尤为重要。 创面愈合是受损部位组织再生和修复的复杂过程,其主要特征是肉芽组织和瘢痕组织形成,而新生血管又是创面愈合的必要条件,它不仅是肉芽组织的主要成分,也为组织修复提供必要的营养成分。创面修复的时间不同,其快慢取决于进入伤口的修复细胞数目及其增生的速度,而趋化因子和生长因子对修复细胞的进入及其增生起到重要作用,创面愈合的各个阶段都有生长因子参与。长期以来创面的修复治疗一直困扰着临床医生,人们从创伤愈合的机制上进行了许多研究,目前已明确VEGF、PDGF和TGF-β与创伤愈合的机制关系非常密切。VEGF是一种多功能的特异性细胞因子,作用于血管内皮细胞的专一受体,促进其增殖和迁移,诱导新生血管生成。此外它还可以提高血管的通透性,改变细胞外基质成分,为血管新生提供环境,也为成纤维细胞合成胶原提供物质基础,从而利于肉芽组织和瘢痕组织的形成,促进创面的愈合。PDGF在体内对中性粒细胞、单核细胞及成纤维细胞等有趋化作用,使这些细胞迁移到创伤组织;PDGF也是成纤维细胞的有丝分裂原,诱导成纤维细胞的再生,增加肉芽组织内成纤维细胞的量;PDGF在体内还能激活巨噬细胞,使其合成VDGF,进一步促进血管新生[6]。PDGF对不同细胞的趋化、激活及诱导作用,利于创伤部位的组织修复,加速创面的愈合。目前公认TGF-β是重要的致纤维化细胞因子,可促进成纤维细胞的表型转换。体内TGF-β主要有三型,其中TGF-β1型与瘢痕形成密切相关。TGF-β1刺激成纤维细胞的生长和分化,使其增殖;也诱导其它生长因子聚集到创面,进而使单核细胞被吸引到创面,转化为巨噬细胞。该生长因子还通过上皮细胞、内皮细胞和淋巴细胞来促进间质细胞的增值。有研究发现TGF-β1可通过细胞传代和维持细胞表型的稳定性来维持组织中胶原的大量沉积[8],并能刺激成纤维细胞产生大量的结缔组织生长因子,进而促进瘢痕的形成。此外,TGF-β1对内皮细胞有一定的趋化作用,可诱导血管的新生,促进创面的愈合。 高糖环境下细胞受损,生长因子的分泌减少,且与相应受体的偶联作用下降,不利于肉芽组织及瘢痕的形成,进而影响创面的愈合。此外高糖环境下,营养物质交换障碍,不利于血管的新生,组织修复过程中难以给予充足的营养成分。因此,糖尿病足创面的肉芽组织形成较少,微血管密度较低,糖尿病足创面愈合较普通创面愈合慢。已有研究证实了创面组织生长因子及其受体的减少是糖尿病足创面难以愈合的重要因素,并且局部应用活性生长因子可促进创面的愈合速度。有学者对糖尿病足与VEGF的关系进行了研究,结果发现糖尿病足创面组织中的VEGF基因表达明显少于正常对照或非糖尿病足创面组织相应生长因子的表达[12],这提示糖尿病足创面血管生成受到影响,因而影响创面的愈合。糖尿病足创面与普通慢性创面不同,慢性难愈,因素复杂,因此,糖尿病足创面的治疗也显得尤为重要。在探索糖尿病足治疗的难题上,欧洲一些国家研究出了臭氧疗法。 臭氧于1785年被专家Van Marum首次发现,它是一种强氧化剂,由三个氧原子组成,常温下半衰期约20分钟,易分解,易溶于水。有研究发现肢体缺血的患者,经臭氧治疗后,其肝素化血浆中的血小板释放大量的PDGF及TGF-β1[13]。另一项研究发现暴露于臭氧环境下的成纤维细胞中,TGF-β1相关基因mRNA的稳态水平明显升高[14]。而且过氧化氢可诱导角质蛋白细胞中VEGF的表达,进而促进创面的愈合[15]。 有研究报道臭氧对创伤和溃疡治愈发挥一定作用,而细胞生长因子(VEGF、 TGF-β、PDGF等)在创面愈合中起重要作用,是否臭氧在促进糖尿病足愈合过程中也同样有VEGF、TGF-β、PDGF的参与,本研究将对此进行探讨。 [目的] 1了解臭氧治疗对糖尿病足创面愈合的影响。 2探讨臭氧治疗对糖尿病足局部组织VEGF, TGF-β, PDGF表达的变化影响。 [方法] 选择2012年3月-2013年1月间,在南方医科大学南方医院内分泌科确诊的符合诊断标准的糖尿病足患者,共50例,采用随机分组设计方法,将合格受试病例分为常规组、臭氧组,每组各25例,两组患者的年龄、性别、病程、病情等一般资料比较无显著性差异(P0.05)。两组均采用规律换药,控制血糖,改善循环,营养神经的综合治疗,臭氧组在常规组上加用臭氧气浴治疗。以20天为一个疗程,观察临床疗效及局部创面的修复情况。(1)在治疗前和治疗后第3、7、11天取创面分泌物,采用酶联免疫吸附方法检测局部组织VEGF、TGF-β、 PDGF表达.(2)常规组和臭氧组各取10例,在治疗前、治疗后第11天取创面局部组织,采用免疫组织化学方法和酶联免疫吸附方法检测局部组织VEGF、TGF-β、PDGF表达,采用masson染色和HE染色观察组织病理变化及胶原纤维表达。 [结果] 1、两组治疗前后疗效对比：臭氧组患者痊愈6例,显效12例,有效5例,无效2例,总有效率92.000%;常规组痊愈3例,显效7例,有效6例,无效9例,总有效率64.000%。臭氧组和常规组比较,差异有统计学意义,表明臭氧组疗效优于常规组(P0.05),两组VEGF、TGF-β、PDGF在治疗后第3天浓度开始升高,VEGF第7天达高峰,第11天有所下降,TGF-β、PDGF在第11天继续升高,说明两组均能促进糖尿病足局部创面愈合。臭氧组治疗后的VEGF、 TGF-β、PDGF表达在各个时间点均比常规组高,提示臭氧组疗效优于常规组。 4、局部组织中VEGF、TGF-β、PDGF表达的变化：治疗前,两组中生长因子(VEGF、TGF-β、PDGF)的表达无明显差异(P0.05),治疗后两组局部组织中的生长因子表达均较治疗前明显增高(P0.05),说明两组均能促进糖尿病足局部创面愈合。治疗后两组VEGF、TGF-β、PDGF表达差异有统计学意义(P0.05),提示臭氧组疗效优于常规组。 5、局部组织中胶原纤维的变化(masson染色)：臭氧组治疗后经Masson染色,呈蓝色的胶原纤维较常规组治疗后显著增多,有显著性差异(P0.05)。 6、局部组织病理变化(HE染色)：两组治疗后成纤维细胞明显增多,且臭氧组治疗后逐渐趋于正常皮肤组织,提示臭氧组疗效优于常规组。 [结论] 臭氧治疗能够促进糖尿病足创面修复,上调局部组织中VEGF、TGF-β、 PDGF表达,促进胶原纤维表达,使溃疡愈合加速,提高了糖尿病足溃疡的治愈率。且使用方法简单,无明显副作用,对糖尿病足治疗有一定的临床优势。