骨髓间充质干细胞移植诱导分化及对肝功能影响的实验研究

作     者：罗衍波 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈斌

授予年度：2009年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100101[医学-人体解剖与组织胚胎学] 10[医学] 

主      题：骨髓间充质干细胞 生物学特性 细胞培养 骨髓间充质干细胞 慢病毒 转染 骨髓间充质干细胞 细胞移植 肝细胞 分化 慢病毒 

摘      要：骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cell,BMSCs)具有极强的自我复制和多向分化潜能,来源广泛,易于获取并且具有低免疫源性,可将BMSCs用于细胞移植治疗,具有非常重要的理论研究意义和临床价值。近年来的研究提示,骨髓间充质干细胞能转分化为肝细胞,这一现象为临床上应用BMSCs移植治疗肝损伤和急慢性肝功能衰竭展示了一个可喜的前景。现已证实,在体外培养条件下BMSCs可由肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)等细胞因子诱导向肝细胞分化,并可释放多种肝细胞因子,但对BMSCs体内移植后能否向具肝细胞功能的细胞分化并对受损肝脏起修复作用的研究则鲜见报道。因此,本课题将大鼠骨髓中分离获得的BMSCs在体外纯化、扩增后通过门静脉移植入肝损伤大鼠体内,观察BMSCs移植后在肝脏内的分布及受损肝脏修复情况,为临床应用提供理论依据。 第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养与签定 目的建立大鼠骨髓间充质干细胞分离和培养扩增的方法,同时对其生物学特性进行研究,为BMSCs作为种子细胞治疗临床疾病提供理论依据。 方法联合应用密度梯度离心法和贴壁细胞培养法进行分离获取大鼠BMSCs,应用流式细胞仪测定细胞表面标记物来鉴定所培养的细胞是否为BMSCs;在倒置显微镜下观察BMSCs的形态学特点,细胞计数测定BMSCs接种贴壁率,并绘制出生长曲线。 结果通过联合密度梯度离心法与贴壁细胞培养方法分离培养出的BMSCs纯度高。BMSCs体外培养生长旺盛,具有活跃的增殖能力。培养的BMSCs阳性表达CD29、CD44,阴性表达CD34、CD45。 结论通过联合密度梯度离心与贴壁细胞培养方法能从骨髓中获得骨髓间充质干细胞;获得的BMSCs在体外生长稳定,且增殖较快,可作为组织工程的种子细胞。 第二部分慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞研究 目的对分离、培养到第三代的大鼠骨髓间充质干细胞进行慢病毒载体介导的基因转染,观察其转染效率及对骨髓间充质干细胞生物活性的影响,为骨髓间充质干细胞基因治疗研究提供实验基础。 方法利用密度梯度离心、贴壁筛选法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞。利用脂质体法进行慢病毒感染大鼠BMSCs。 结果体外分离培养的骨髓间充质干细胞,经携带绿色荧光蛋白(greenfluorescence protein,GFP)的慢病毒转染72h后可见绿色荧光蛋白的表达,96h后达到高峰。转染后的骨髓间充质干细胞体外继续培养,1月后仍可见绿色荧光蛋白的表达,但表达强度较前减弱。在一定病毒复数范围内,慢病毒对骨髓间充质干细胞的转染率随病毒复数的增加而增高,当病毒复数为5时,转染率达到80%以上;但病毒复数超出一定范围后,转染率反而下降。慢病毒转染后的骨髓间充质干细胞生长曲线和未转染的骨髓间充质干细胞生长曲线未见明显变化。 结论慢病毒对大鼠BMSCs有较高的转染率,且携带的GFP能在BMSCs内有效表达,可以作为骨髓间充质干细胞基因治疗的载体和体内示踪。 第三部分骨髓间充质干细胞移植对肝功能影响的实验研究 目的观察同种异体骨髓间充质干细胞移植在肝脏特定微环境下是否向具肝细胞功能的细胞分化并探讨其对大鼠受损肝脏修复作用的可行性。 方法利用密度梯度离心、贴壁筛选法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞。经慢病毒转染后的第3代BMSCs从门静脉植入肝大部分切除大鼠体内,分别于移植后7、14、28d行血清肝功能检测,分析BMSCs对肝功能的作用。移植后的第28d取出肝脏,通过冰冻切片荧光检测,观察BMSCs在大鼠肝脏内定居分布情况。 结果大鼠连续用2-乙酰氨基芴(2-acetylaminofluorene,2-AAF)灌喂6d后出现精神萎靡、厌食、少活动、尿深黄;肉眼见肝脏明显充血肿大、边缘圆钝、表面可见针尖样细小颗粒、呈局灶性,偶见有小出血点;HE见部分肝细胞肿胀、胞质疏松。术后BMSCs移植组和DMEM/F12注射组各肝功能检测指标均随着时间的延长逐渐恢复;BMSCs移植组与DMEM/F12注射组比较,ALB、ALT和AST均有显著性差异(P0.05)。术后28d,BMSCs移植组与正常组比较,ALB、ALT、AST、ALP均无显著性差异(P0.05);DMEM/F12注射与正常组比较,ALB、ALT均有显著性差异(P0.05)。这些表明BMSCs移植对肝功能的恢复有促进作用。术后冰冻切片,BMSCs移植组可见BMSCs定居于肝脏内,主要在汇管区周围,肝实质里也可见散在分布,而心、肺、脾、肾未见BMSCs。HE染色BMSCs移植组肝小叶结构正常,肝索排列规则;DMEM/F12注