Ascl2/miR-200/ZEB轴调控结肠癌细胞EMT-MET的可塑性研究

作     者：田音 

作者单位：第三军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：汪荣泉

授予年度：2013年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：Ascl2 miRNA-200家族 结肠癌细胞 上皮-间质转化 

摘      要：研究背景及目的： 在全世界癌症死亡率中，结直肠癌由于其早期的低诊断率排位第三，而在发达国家的发病率和死亡率中，其则居首位。在世界范围内结肠癌的诊疗一直都是一个巨大的难题，现有的治疗方法包括手术切除、化疗等，但都未能阻遏结肠癌再次的复发和其他部位的转移。在早期阶段，其诊断极为困难，而当结肠癌发展到中晚期时，其向周围组织浸润、侵袭和远处转移又为其根治性治疗带来巨大的挑战，因此寻找治疗结肠癌的新方法势在必行。上皮间质转化即EMT (epithelial-mesenchymal transition,EMT)，已在乳腺癌、结肠癌、前列腺癌等上皮样肿瘤中被发现,同时在人类肿瘤细胞株和小鼠异常活化模型研究中证实EMT能使肿瘤细胞传播和流通到周围组织，因而EMT也被认为是肿瘤浸润、转移的一个非常重要的机制。在大量的文献中提示miRNA-200家族通过Zeb1/2参与调节了EMT的转录调控过程。现关于miRNA的研究主要集中在下游调节，而对已有转录因子等蛋白质通过调控miRNA异常表达而调节下游的研究较为缺乏，且据现有文献报道，关于miRNA的转录调节机制目前仍不清楚。Ascl2(Achaete scute-like2)在大量的文献研究中证实其控制正常成体肠隐窝干细胞“命运的能力。并已证实Ascl2在维持结肠癌干细胞自我更新方面发挥重要的作用。Ascl2作为最新发现的调节肿瘤干性因子调节肿瘤干细胞干性的同时是否影响了EMT进程目前尚不清楚，且Ascl2调控miRNA尚未见任何文献报道。探讨肿瘤干性因子Ascl2对结肠癌细胞上皮-间质转化的影响。因此，对Ascl2在EMT中的调节作用的研究，我们选择了人结肠癌HT-29细胞和LS174T细胞。 方法及结果： 在人肠道粘膜中，免疫组织化学检测证实Ascl2仅表达在正常肠道粘膜隐窝内的干细胞中而在结肠腺癌组织中出现表达增高;Ascl2干扰后，HT-29和LS174T细胞的肿瘤侵袭能力在细胞生物学行为上表现出明显的抑制，而Western-blot和real-timePCR实验检测发现上皮细胞的标志E-cadherin表达明显增高，间质细胞的标志N-cadherin、Vimentin、Snail和Slug的明显降低，即出现EMT的逆转现象—MET。microRNA芯片筛选出miRNA-200家族(miR-200a，miR-200b，miR-200c，miR-141，miR-429)在LS174T细胞中出现2倍以上的表达上调，行real-time PCR验证证实了其表达差异。我们同时发现miRNA-200家族调节EMT相关蛋白ZEB1/2在mRNA水平和蛋白表达明显下降。在荧光素报告实验提示的Ascl2对于miR-200b-200a-429和miR-200c-141启动子的转录激活有抑制作用。干扰后的LS174T细胞分别转染negative control inhibitor(NC-inhibitor)、 miR-200a inhibitor， miR-200b inhibitor，miR-200c inhibitor，miR-141inhibitor和miR-429inhibitor后行Western-blot和real-time PCR实验检测，发现miR-200a inhibitor，miR-200b inhibitor和miR-429inhibitor出现EMT现象，且部分恢复shRNA-Ascl2/LS174T细胞的细胞生物学行为。 结论： Ascl2的RNA干扰可以导致结肠癌细胞生长抑制，促进了结肠癌细胞EMT-MET的发生发展。Ascl2通过调节miR-200家族mir-200a-200b-429和mir-200c-141两条调控轴参与转录调节结肠癌细胞EMT过程。为肠粘膜更新的干预治疗提供了新的理想靶位，为炎症性肠病及其肠道肿瘤的防治和治疗开拓一种不同的思路。