Twist基因质粒构建及其与结肠癌细胞EMT的相关性研究

作     者：张丽永 

作者单位：天津医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李卫东;付蔚华

授予年度：2010年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：Twist基因 上皮间变 质粒构建 结肠癌 

摘      要：目的：通过构建稳定高表达的Twist基因真核表达质粒载体,探讨Twist基因在结肠癌细胞发生上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)中的作用机制,进而明确其对恶性肿瘤转移的影响。 方法：1.以pcDNA4/myc-His A-Twist为模板,运用PCR技术获取人类Twist基因片段,运用双酶切、定向克隆技术将目的片段克隆入质粒pTracer-CMV/BSD,构建质粒pTracer-CMV/BSD-Twist。2培养SW480结肠癌细胞,采用阳离子脂质体转染技术转染SW480结肠癌细胞,分为pTracer-CMV/BSD-Twist组(含有目的基因)、pTracer-CMV/BSD组(不含有目的基因)和未转染组三组。3.转染48hrs后收集细胞,采用荧光实时定量PCR和Western blot技术分别检测三组细胞的Twist基因、Ecadherin基因、Vimentin基因的mRNA转录水平和蛋白表达水平。 结果：1.经双酶切、基因测序等方法证实质粒pTracer-CMV/BSD-Twist成功构建。2.转染48hrs后,倒置荧光显微镜下可见质粒pTracer-CMV/BSD-Twist组和质粒pTracer-CMV/BSD组中细胞表达绿色荧光蛋白,强度高而密集。3.三组细胞Twist基因、Ecadherin基因、Vimentin基因的mRNA转录水平和蛋白表达水平显示：①质粒pTracer-CMV/BSD-Twist组的Twist基因mRNA转录水平和蛋白表达水平高于质粒pTracer-CMV/BSD组和未转染组,差异有统计学意义(P0.05)。 ②质粒pTracer-CMV/BSD-Twist组的Ecadherin基因mRNA转录水平和蛋白表达水平低于质粒pTracer-CMV/BSD组和未转染组,差异有统计学意义(P0.05)。③质粒pTracer-CMV/BSD-Twist组的Vimentin基因mRNA表达水平和蛋白表达水平高于质粒pTracer-CMV/BSD组和未转染组,差异有统计学意义(P0.05)。4.相关性分析结果显示mRNA表达水平和蛋白表达水平,Twist基因与Ecadherin基因的表达均呈负相关(P0.01),与Vimentin基因的表达均呈正相关(P0.01)。 结论：1.成功构建质粒pTracer-CMV/BSD-Twist。2该质粒转染SW480结肠癌细胞后Twist基因呈高表达、Ecadherin低表达、Vimentin基因高表达,这表明Twist基因可能通过抑制Ecadherin蛋白表达,上调Vimentin蛋白表达促进了EMT分子事件的发生,进而增强肿瘤细胞的转移能力。