TK-1和TIMP-1基因共表达抑制大鼠球囊拉伤后颈动脉内膜增生的实验研究

作     者：张枫 

作者单位：福建医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：朱鹏立

授予年度：2015年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：组织激肽释放酶1 基质金属蛋白酶组织抑制物1 基因治疗 内膜增生 

摘      要：目的将介导人的TK-1和TIMP-1基因共表达重组腺病毒载体转染大鼠颈总动脉球囊拉伤后血管内膜增生模型,观察并比较单基因(Ad-hTK-1或Ad-hTIMP-1)载体或双基因共表达载体(Ad-hTK-1-hTIMP-1)对拉伤后血管内膜增生的影响及可能机制。方法应用经典的球囊拉伤法,建立SD大鼠左颈总动脉拉伤后血管内膜增生动物模型,取250-350g雄性SD大鼠随机分为6组:假手术组,单纯拉伤组,对照病毒组,Ad-hTK-1组,Ad-hTIMP-1组,双基因(Ad-hTK-1和Ad-hTIMP-1)组。除假手术组外,其余各组用2F球囊导管从颈外动脉进入颈总动脉并拉伤,分别在各组大鼠拉伤颈动脉处注射生理盐水(30μl)、对照病毒、Ad-hTK-1、Ad-hTIMP-1或双基因病毒(1×109pfu/只,在30μl病毒保存液里)。局部干预14天后处死大鼠,组织学检测内膜增生情况(计算内膜/中膜面积比),共聚焦免疫荧光检测hTK-1、hTIMP-1基因的表达,蛋白免疫印迹法检测hTK-1、hTIMP-1、MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平,免疫组化检测PCNA表达水平。结果1.成功建立球囊拉伤大鼠颈总动脉的血管内膜增生动物模型(第一部分),球囊拉伤后7、14、28 d内膜面积(IA)和内膜/中膜面积比值(I/M)逐渐增大(趋势检验P0.05)。与对照病毒干预大鼠相比,Ad-hTK-1或Ad-hTIMP-1或双基因局部干预14d后,均可明显减少拉伤后大鼠颈总动脉IA(0.110±0.015比0.160±0.010;0.121±0.016比0.160±0.010;0.081±0.008比0.160±0.010;P均0.05)。Ad-hTK-1或Ad-hTIMP-1或双基因干预后,均能显著下调PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平(均P0.01)。与Ad-hTK-1或Ad-hTIMP-1单基因比较,双基因联合共表达可进一步降低PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平(均P0.01)。结论1.成功构建大鼠颈总动脉球囊拉伤后血管内膜增生模型,局部应用携带的目的基因TK-1和(或)TIMP-1的重组腺病毒载体,可将目的基因成功转入颈总动脉,并获得有效表达。***-1或TIMP-1单基因过表达均可抑制球囊拉伤后内膜增生,与单基因(TK-1或TIMP-1)表达载体相比,同一载体介导的双基因(TK-1和TIMP-1)联合共表达抑制球囊拉伤后的大鼠颈动脉内膜增生具有叠加效应,可能的机制与下调PCNA、MMP-2和MMP-9的表达有关。3.双基因共表达抑制颈动脉内膜增生效果优于单基因,为多基因治疗在临床前期治疗奠定实验基础。