TRIM24在肝细胞癌中表达的研究

作     者：刘萧 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨定华

授予年度：2013年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：肝细胞癌 肝癌细胞株 TRIM24 免疫组化 siRNA 

摘      要：背景与目的 原发性肝癌是世界第五大最常见的肿瘤,全球每年约有100万人罹患此病以及因此病死亡。尽管有关原发性肝癌的分子生物学特性以及其发生发展机制研究繁多,以及诊断技术的显著进步与外科治疗水平的提高,但原发性肝癌患者的预后仍然不太理想。原发性肝癌外科手术切除后5年复发率仍高达65%以上,转移复发是影响原发性肝癌预后的主要因素之一,因此,研究HCC的分化增殖及复发转移倾向的分子机制,对HCC的病程进展、预后评估有重要意义。近年来,多项研究表明,TRIM24(也称作Tif1a)作为TRIM (tripartite motif)家族重要成员之一,参与了细胞凋亡、周期调控等重要的生命过程,高表达于多种肿瘤细胞,与肿瘤的分化、增殖及发生发展有密切关系,但是在小鼠的肝癌研究中,它是一个肝脏特有的肿瘤抑制因子。然而在人类的HCC中,还没有任何关于TRIM24蛋白表达情况及其与临床病例参数关系研究的报道。 本研究采用免疫组化技术检测肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)患者中肿瘤组织及非癌组织中TRIM24蛋白的表达情况,并分析TRIM24蛋白的表达与患者临床病理特征之间的关系。采用siRNA干扰技术转染HepG2干扰TRIM24的表达,检测转染前后TRIM24蛋白、细胞凋亡相关蛋白、细胞周期蛋白与EMT相关蛋白表达的变化情况以及采用流式细胞仪检测干扰TRIM24对细胞凋亡及细胞周期的影响,体外研究TRIM24在HCC的发生发展中所起的作用,为HCC的临床诊断、病程进展和预后评估提供新的线索。 方法 1、收集南方医科大学南方医院肝胆外科2010年11月～2012年7月接受手术治疗的HCC患者的组织标本,标本均在离体2小时内取材固定,术后均经病理学检查证实。 2、采用免疫组化技术检测83例HCC患者的癌组织以及相对应的非癌组织中的TRIM24蛋白的表达,并进一步分析癌组织中的TRIM24蛋白表达与临床病理特征的关系。 3、采用荧光定量PCR检测L02及五种不同侵袭转移潜能的肝癌细胞株HepG2、SMCC-7721、97L、97H、HCCLM3中TRIM24mRNA的表达情况,筛选出靶细胞。 4、采用siRNA干扰技术转染肝癌细胞株HepG2干扰TRIM24表达,收集细胞进行蛋白提取及流式细胞检测。 5、Western Blot检测转染前后TRIM24蛋白表达以及细胞凋亡、细胞周期与EMT相关蛋白表达情况。流式细胞周期检测转染前后细胞周期变化;流式细胞凋亡检测细胞转染前后凋亡情况。 6、统计学处理：应用SPSS13.0统计软件对数据进行统计学处理,TRIM24在癌组织和非癌组织中蛋白阳性表达率的比较,以及在不同临床病理特征情况下TRIM24在癌组织中的阳性表达率的比较均采用Pearson Chi-Square检验。HCC患者临床预后的影响因素分析采用Cox多因素回归分析。TRIM24的蛋白与患者术后无瘤生存期的关系采用生存分析(Kaplan-Meier曲线,log-rank法)。荧光定量PCR的实验数据采用2-ΔΔCT进行处理,每个样本重复实验进行3次实验,计算各样本平均CT (threshold cyclenumber)值和△CT值(ΔCT=CT TRIM24-CTGAPDH),计算2-ΔΔCt (ΔΔCT=ΔCT目的-ΔCT对照),其数值表示目的表达值相对于对照表达值的相对倍数,计量资料以X±SD表示。L02及五种不同侵袭潜能肝癌细胞株TRIM24mRNA的比较采用方差分析和LSD-t检验。细胞凋亡及细胞周期数据的比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05,采用双侧性检验。 结果 1、免疫组化检测TRIM2483例肝细胞癌组织标本中的表达,结果显示：TRIM24在癌组织中表达阳性51例(51/83,61.4%),相应的非癌组织表达阳性4例(4/83,4.8%)。TRIM24的阳性表达与患者AFP水平,病理分化程度,术后复发,肝内转移及术后无瘤生存时间相关,具体为AFP≥400ug/L患者TRIM24阳性率显著高于AFP400ug/L患者(P=0.036);病理分化程度越低,TRIM24表达阳性率越高(P=0.004);TRIM24表达阳性率在术后复发患者(P=0.000006)及发生肝内转移患者(P=0.004)中显著高于无复发及无肝内转移者;TRIM24表达阳性的患者术后复发时间显著低于表达阴性者(P=0.002)。单因素回归分析结果表明肝硬化及TRIM24是影响HCC患者术后复发的独立预后因素,Cox多因素回归分析表明TRIM24表达阳性患者的术后复发风险是表达阴性患者的5.327倍(HR=5.327;95%可信区间2.218-12.795;P0.01)。Kaplan-Meier生存分析显示TRIM2