被动靶向的磁共振成像及近红外成像双模态纳米探针研究

作     者：杨楠楠 

作者单位：南京大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张宗军;卢光明

授予年度：2013年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：磁共振成像 荧光成像 双模态探针 近红外成像 体内成像 MRI 

摘      要：第一部分SPIO@PEG/HID双模态探针的合成及表征 目的：合成基于Fe304的磁性纳米颗粒,在其外修饰PEG并链接近红外花菁染料,构建磁性及荧光双模态成像探针。并对该探针的性质进行表征。 材料及方法： 合成基于Fe304的磁性纳米颗粒。称取醋酸钠(Na Ac)1.5g,丙烯酸钠(Naacrylate)1.5g,量取乙二醇(EG)5mL,二乙二醇(DEG)15mL,磁力搅拌5h,至所有固体溶解。加入Fecl3,6H2O0.54g,将溶液移入反应釜(35mL)中。烘箱升温至200℃,反应10h,自然温度下冷却至室温。将反应溶液磁分离法用乙醇溶液清洗6次,后ddH2O清洗3次。最终产品溶解于30mLddH2O,4℃保存备用。 PEG修饰及近红外染料的链接。将100mgPEG溶于50mL四氢呋喃中,机械震荡至固体溶解。量取前一实验获得磁性纳米材料溶液5mL,以质量比Fe：PEG=13的比例加入PEG,最终四氢呋喃定容至30mL。机械搅拌过夜。所得溶液用磁分离法清洗6次。后溶于四氢呋喃内,定容至10mL。取所得溶液2mL,加入IR808溶液100uL,溶于20mL无水乙醇中,机械搅拌过夜。所得溶液经磁分离法清洗至上清无荧光。将所制得探针SPIO@PEG/HID超声分散至水溶液中。 探针性质表征。分别将SPIO、SPIO@PEG、SPIO@PEG/HID制样。采用投射电镜(transmission electron microscopy, TEM)观察三种纳米粒子的形态及核心粒径;通过傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)分析三种粒子的表面基团。使用振动样品磁强计(vibrating samplemagnetometer,VSM)、荧光光度仪、磁共振等分析SPIO@PEG/HID的磁学及光学性质。 结果：SPIO与HID成功连接,得到磁性及荧光双模态成像探针。投射电镜结果显示PEG成功修饰与SPIO外层,最终纳米粒径约在110nm左右。红外光谱图进一步显示纳米颗粒外基团修饰变化,显示PEG及HID成功连接。荧光成像示SPIO@PEG/HID在水中荧光稳定,吸收光谱峰约在800nm,适宜体内红外成像。磁性分析显示SPIO@PEG/HID余磁为0,为超顺磁性材料,其弛豫率约为62.6mM-1xS-1,适合作为MR成像的对比剂。 结论：本实验所得磁学及荧光双模态探针SPIO@PEG/HID具有光学特性稳定,磁学参数理想,具备了作为双模态对比剂的条件,为进一步的体内试验奠定了基础。 第二部分SPIO@PEG/HID探针细胞靶向实验 目的：通过SPIO@PEG/HID与人胚肾细胞293T及人乳腺癌细胞株MCF-7共孵育的方法评价探针的毒性,体外成像光学及磁性成像效果,分析两种细胞内材料含量的差异性,进一步探讨该探针潜在肿瘤靶向性。研究探针体外成像能力及靶向能力。 材料及方法： 1、将SPIO@PEG/HID纳米颗粒与人乳腺癌细胞株MCF-7共同孵育后,(1)通过普鲁士蓝染色定性观察细胞对SPIO@PEG/HED纳米颗粒吞噬情况;(2)采用二甲基四氮唑法(Microculture tetrazo lium assay, MTT)测SPIO@PEG/HID对细胞活力的影响,设置人胚肾细胞293T细胞作为对照组;(3)通过细胞透射电镜(TEM)分析纳米颗粒在细胞的分布：收集细胞悬液,用2.5%戊二醛溶液40℃固定1h,室温下1%四氧化锇溶液固定1h, PBS清洗2-3次,每次5min,梯度乙醇脱水,环氧树脂包埋,常规制作超薄切片,转移到铜网,透镜观察颗粒在细胞内的分布情况。 2、将SPIO@PEG/HID分别以20ug/mL、50ug/mL、100ug/mL的浓度与MCF-7及293T细胞共孵育24h,后分别收集细胞。(1)将细胞重悬于1mL1%琼脂糖溶液内,机械震荡使其分布均匀,置于3.0TMR上扫描。(2)取一组细胞,以3000rp/min离心1min后去上清,置入IVIS荧光成像系统内成像。(3)将一组细胞溶于1mL饱和盐酸溶液中,静止20min,后稀释40倍,送于ICP测定Fe元素含量。 结果：MTT示在SPIO@PEG/HID孵育浓度达100ug/mL下,人胚肾细胞293T保持80%的活力,证明SPIO@PEG/HID细胞毒性低。普鲁士蓝及细胞荧光成像示SPIO@PEG/HID粒子主要集中于胞浆内,且细胞内荧光稳定,可用于细胞内荧光成像。293T及MCF-7细胞株内纳米颗粒含量的对比,提示不论通过磁学或者荧光手段均可在细胞层面区分癌细胞与正常细胞,提示该纳米探针具有潜在的肿瘤靶向性,为进一步体内试验奠定了基础。 结论：SPIO@PEG/HID纳米颗粒具有毒性低,细胞内