土大黄基源鉴定及质量标准研究

作     者：邓玉环 

作者单位：山西省中医药研究院 

学位级别：硕士

导师姓名：李安平;倪艳

授予年度：2016年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：土大黄 鉴别 DNA条形码 土大黄苷 酸模素苷 含量测定 

摘      要：目的:建立传统鉴别方法、分子生物学鉴别方法对土大黄药材进行基源鉴定,同时,研究建立土大黄药材与饮片质量标准。方法:通过对土大黄文献调研,检索了历代本草、各地收录标准及炮制规范;进行实地调研,采集到3期18地55份（其中用于鉴定研究35份,用于质量标准研究20份）土大黄样品;采用多种手段包括原植物实物鉴别、性状鉴别、显微鉴别及DNA分子鉴别等对土大黄进行定性鉴别;首次采用特异性引物PCR的方法检测酸模属多种植物与伪品山大黄。参考各地土大黄质量标准收录并结合本省临床用药习惯及制剂用土大黄品种等确定土大黄山西省地方标准的收载品种;采用TLC对其进行真伪优劣定性鉴别、检查;采用HPLC对酸模素苷、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚进行含量测定;采用中国药典2015版四部附录限量检查法、药品杂质分析指导原则对水分、灰分等项目进行检测。结果:1.通过传统鉴别与DNA条形码鉴别相结合鉴定,结果表明:35份土大黄样品中编号2、8、11、13、14、15、18、19、23、24、25、28、29、30、32、33为巴天酸模;编号3、20、21为皱叶酸模、编号5、6为长刺酸模;编号1、9、12、31为羊蹄;编号4、7为可以确定为酸模属植物,无法确定种名;编号22、26为齿果酸模;编号10为尼泊尔酸模;编号16、17为锐齿酸模;编号34、35为华北大黄,是土大黄易混伪品,也叫山大黄;编号27样品DNA提取失败,分析原因是饮片陈旧;基于酸模属多种植物的psbA-trnH序列,设计出一对特异性引物通过聚合酶链式反应可快速检测酸模属多种植物及其伪品。综合上述鉴定结果以及参考各地土大黄质量标准收录并结合本省临床用药习惯及制剂用土大黄品种等确定山西省地方标准中土大黄基源拟将收载巴天酸模、皱叶酸模和齿果酸模。2.建立TLC鉴别及检查方法。采用薄层层析法分析发现酸模属植物均含有大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等成分;同时含有其专属性成分酸模素苷,不含有土大黄苷,通过检测后两种成分可与其伪品山大黄进行区分。为此分别研究建立了【鉴别】、【检查】项。3.建立HPLC含量测定项。本研究采用依利特Hypersil BDS C18（250mm×4.6mm,5μm）色谱柱;以甲醇-0.1%磷酸水梯度洗脱序列为0-14min（B%为60%→39%）,14-15（B%为39%→16%）,15-38（B%为16%）;流速:1.0ml/min;检测波长:225nm,254nm的含量测定方法可以同时测定酸模属植物酸模素苷、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚四种化学成分。结论:1.以原植物性状结合DNA分子条形码鉴别,可较好地解决酸模属植物分类复杂、鉴定困难的问题。2.在含量测定中发现来源于同科同属的羊蹄饮片所含蒽醌类成分明显高于其他几种酸模属药材。这一发现可以为土大黄与羊蹄分类研究提供实验依据。3.酸模属植物无土大黄苷成分,其伪品土大黄含有大量土大黄苷,以此作为土大黄【检查】项,可以实现真伪鉴别;本文所建立薄层鉴别方法,其图谱斑点清晰,分离度好;四种指标性成分含量测定方法简便快捷,重复性、稳定性好,加样回收率符合要求。所建立质量标准可用于土大黄药材及饮片的质量控制。