酸环境对人髓核间充质干细胞生物学活性的影响

作     者：王汉邦 

作者单位：安徽医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：申才良

授予年度：2016年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

主      题：椎间盘退变 髓核间充质干细胞 酸环境 生物学活性 

摘      要：目的观察不同程度酸性条件对成人髓核间充质干细胞(NPMSCs)生物学活性的作用,发掘椎间盘的可能退变机制。方法筛选6例脊柱侧凸需矫形手术患者,留取手术过程中摘除的6个PfirrmannⅠ级或Ⅱ级腰椎椎间盘,用胶原酶消化髓核组织,分离细胞,体外培养,观察细胞形态。选择培养的P2代细胞,运用流式细胞仪检测间充质干细胞等表面抗原标志物;使用分化诱导培养液诱导成骨、成软骨、成脂细胞,2周后分别染色液对诱导的细胞染色,观察细胞三系分化能力。参照国际干细胞治疗协会(ISCT)给出的间充质干细胞(MSCs)的判定准则,综合鉴定分离的细胞。使用不同pH值的培养基培养P2代细胞后,用CCK-8法检测不同培养时间的细胞增殖能力,用流式细胞仪检测不同pH培养基作用的细胞凋亡率,使用实时荧光定量(RT-PCR)检测P2代细胞“干性基因及酸离子通道家族蛋白基因表达情况。结果分离的P0代细胞均贴培养瓶底壁生长。分离培养P2代细胞表面抗原检测示高表达CD90、CD105、CD73,三者表达比例分别达96%、95%、94%以上,却低表达CD45、CD34、HLA-DR(均低于4%)。通过使用特殊染色剂染色结果表明实验中分离得到的细胞均可向骨、脂肪及软骨细胞方向分化。参照ISCT制定MSCs的判定准则,认为这种细胞是NPMSCs。CCK-8检测结果示分离得到的细胞在不同pH培养液培养后1、3天不同组细胞吸光度差异无统计学意义(P0.05);5天后各组细胞吸光度差异有统计学意义(P0.05),且吸光度随pH值降低而减小。凋亡率比较结果示pH值7.4组的细胞凋亡率最小,各组有统计学差异(P0.05)。RT-PCR检测示pH7.4组“干性基因及酸离子通道蛋白基因最高,高于其余各组(P0.05),基因表达量随着培养液pH值减小而降低。结论不同层次的pH酸环境条件下培养成人NPMSCs3天增殖能力未见显著变化,作用5天后可以看出低pH环境明显抑制NPMSCs的增殖能力以及基因表达,加快细胞凋亡,而且这种作用随着pH降低越明显。